常用溶液.docVIP

IPTG 使用1mM 配置 1M 1000× Ampicillin 使用100μg/ml 配置 100mg/L Gentamycin 使用 15μg/ml Kanamicin 使用10μg/ml 配置10mg/L DP 2,2’-二连吡啶 配置100Mm 酒精溶解 FeSO4 使用40μΜ，配置20mM 盐酸溶解1. 菌种、质粒 、引物来源大肠杆菌TOP10克隆宿主菌本实验室AV-1鳗弧菌表达宿主本实验室野生型鳗弧菌MVM425本实验室载体质粒pUC18Novagen 2.① LB液体培养基:按酵母粉5 g/l，胰蛋白胨 10 g/l，NaCl 5 g/l称取各组分，加入去离子水后用10 mol/l NaOH调pH至7.0，并用去离子水定容。混匀后121高压蒸气灭菌25 min。 LB氨苄固体培养基:按2g/100ml向LB液体培养基中加入琼脂粉，121高压灭菌25 min。趁热摇匀，冷却至约60，加入Amp至终浓度100 (g/ml，摇匀后倒入培养皿中。凝固后于37 恒温箱中烘干，保存在4 冰箱中。 A-I-X平板配制: 每100ml的LB中加入 a 100(l Amp(50mg/ml) b 100(l IPTG(24mg/ml) c 200(l X-Gal(20mg/ml) 用于琼脂糖凝胶电泳的试剂 0.7 %琼脂糖凝胶：称取0.28 g琼脂糖溶于40 ml 1(TAE缓冲液中，在微波炉中加热，待琼脂糖完全溶解后迅速倒入制胶台。冷却40分钟后可点样电泳。 10(TAE缓冲液：将2.42 g Tris碱溶于400 ml双蒸水中，加入5.71 ml冰乙酸和 10ml 0.5 mmol/L的EDTA，定容至1000ml。使用前稀释10倍。 用于SDS电泳的试剂 5(样品缓冲液：分别加入0.6 ml 1 mol/l Tris-HCl (pH6.8)，5 ml 50%(v/v)甘油， 2 ml 10%SDS，0.5 ml 2-巯基乙醇(DDT)，1 ml 1%溴酚蓝，补蒸馏水至10 ml。使用时与样品混合，稀释至1(。 5(电泳缓冲液：称取15.1 g Tris碱，72.0 g甘氨酸，5.0 g SDS，加去离子水定容至1000 ml，使用前稀释至1(。 染色液：称取2.5 g考马斯亮蓝R-250，加入450 ml甲醇，100 ml乙酸，定容至1000 ml，用滤纸过滤后可使用。 脱色液：量取100 ml乙醇，50 ml冰乙酸，稀释至500 ml。ELISA及western实验中所需要的一些试剂的配制方法 ELISA洗液及HRP标记抗体稀释液H 7.4，PBST表3.ELISA及western实验试剂配方NaCl 2.0克 KH2PO4 0.2克 Na2HPO4·12H2O 2.9克 NaN3 0.2克 KCl 0.2克 H2O 至1000ml Tween 20 0.5ml 4°C保存备用Western blot 抗体或免疫球蛋白稀释液0.01mol/L pH 7.2PBS配方见表3.5。 表3.pH 7.2的PBS配方NaH2PO4·2H2O 0.39克 Na2HPO4 1.27克 NaCl 0.85克 NaN3 200mg H2O（蒸馏水） 至?1000ml 连接 目的基因与pMD19 T-simple Vector相连，连接体系见表3.: 表3.T-载体连接体系 物质 用量 pMD19 T-simple Vector 目的基因 Solution 1(l 4(l 5(l 总体积 10(l 连接反应在16下，反应8h。 转化 将连接液转化Top10大肠杆菌感受态细胞，涂LB(A-I-X)的LB琼脂平板，置37恒温箱，培养14-18h。 菌落PCR 从LB(A-I-X)平板上挑取几个白色单菌落并做好对应标记，分别接入含800(l低盐培养液的无菌EP管中， 250rpm培养3h左右。每个菌取200(l在沸水中煮5min，12000rmp室温离心2min。上清作为PCR的模板DNA,PCR体系见表3. 表3. Premix Taq (Takara)反应体系 物质 用量 ExTag Master Mix 模板DNA（验证的菌） 引物M13 forward 引物M13 reverse ddH2O 6.5(l 2 (l 1.3 (l 1.3 (l 1.9 (l 总体积 13 (l 反应条件 预热 95 1 min 模板DNA变性 95 30 sec 引物退火 55 50 sec 35 cycles 链延伸