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第四章 电泳（electrophoresis）技术 基本原理 一、电泳的概念：带电颗粒在电场中向所带电荷相反的电极移动的现象，称之为电泳现象。1937年，Tiselius利用电泳现象制造了界面电泳并进行蛋白质研究。此后，各种电泳技术及电泳仪不断产生和发现。应用也越来越广，在生物化学、分子生物学和法医学等方面有着广泛应用，主要用于分离、鉴定和定量分析。 颗粒或质点，如果能够解离或吸附带电颗粒或质点，就会带电荷，而在电场中移动。不同性质的颗粒或质点，所带电荷性质和质量不同，在一定电场强度中移动的方向和速度不同，就可以分离开来。 二、电泳的迁移率（mobility，μ）：作用于带电颗粒使其在电场中运动的力（F）等于颗粒所带电荷（Q）与电场强度（E）的乘积，即为： F=QE 而带电颗粒在电场中运动受到一定的阻力（F′），对于球形颗粒，此阻力遵循Storke定律。 F′=6πηrν 公式中r为颗粒半径，η为介质的粘度，ν为泳动速度。 当带电颗粒以稳态运动时，作用力等于阻力，即为： F= F′ 因此 QE=6πηrν ν/E=Q/6πηr 电泳迁移率是指在单位电场强度（1V/cm）时的泳动速度。 μ=Q/6πηr 这是一种理想状态下，实际电泳条件下，干扰因素很多。 迁移率的单位为： μ=ν/E=d/t·E=cm/s·V/cm=cm2/V·s d为颗粒运动的距离，以厘米（cm）计； t为时间，以秒（s）计； E为电位梯度（V/cm）。 在确定的条件下，某物质的迁移率为常数，是该物质的物理化学常数。 迁移率也可以写成： μ=ν/E=d/t·△V/L=dL/△Vt △V为实际电泳所施交的电压差，L为电泳支持物长度。如有两种带电物质在同一电场中泳动，彼此分离情况可以用泳动距离的差值来判断。例如，A,B两带电颗粒，其泳动距离分别为dA, dB,则 dA=μA△Vt/L, dB=μB△Vt/L 两者泳动的距离差为： △d= dA－dB＝（μA－μB）t·△V/L 由此可见，在同一电场下，两极间距离不变，通电时间t后，A、B两物质能否分离，由两者的电泳迁移率判断。 三、电泳的分辨率： 四、影响电泳分析效率的因素：电泳所加电压与电泳的热效应关系密切，热对电泳的影响很大，温度升高，电泳迁移率和自由扩散增加，介质粘度下降，而影响电泳效果。在电泳装置中如何解决电泳的热效应是一个重要问题。由上述可见，影响电泳的因素很多，主要有： 1、电场强度：电场强度是指单位长度（cm）的电压降，即电势梯度。例如支持物长度加盐桥长度为（即两极缓冲液面间距离）20cm，所施加的电压差为200V，则电场强度为10V/cm。电场强度越强，带电质点泳动速度越快。根据电场强度的大小，可以将电泳分为常压电泳（100－500V）和高压电泳（500－1000V）,前者电场强度为2－20V/cm，后者为20－100V/cm。常压电泳所需时间长，高压电泳所需时间短。 2、溶液pH值：溶液的pH值决定被分离化合物的解离程度，也决定质点所带电荷的多少。电荷越多，泳动速度越快。对于两性电解质，其溶液pH离等电点越远，质点所带电荷越多，向相反电极泳动速度越快。 3、离子强度(ionic strength)：缓冲溶液的离子强度越高，质点的电泳速度越慢，但区带分离度越清晰，热效应越大。反之则越快，区带分离度越差，热效应低。带电质点在溶液中会吸引相反符号的离子，离子强度越高，其周围吸引的离子越多。它使该质点带净电荷减少，而电泳迁移率下降。离子的这种效应是与其浓度和价数相关的。因此，离子强度可表示为： 离子强度＝1/2∑1sCiZ2i 式中s表示共有s种离子，Ci Zi分别代表每种离子浓度（mol/L）和价数。价数越高的离子，离子强度越强。如浓度同为1 mol/L的KCl和CaCl2，离子强度分别为1和3。故在电泳时，离子强度一定要选择最佳值。 此外，缓冲液的其它性质对电泳也有一定影响，如介电常数，化学性质，温度，粘度和是否有极性分子存在等。 4、被分离质点或颗粒的性质：被分离质点的性质决定其在溶液中的状态及所带电荷性质。大多数分子由于其本身具有可解离基团，在溶液中解离而带电荷，如蛋白质、核酸。有些胶体分子可以在溶液中吸引带电离子而呈电性。所带电荷越多，在电场中泳动越快。所带电荷性质与溶液pH有关，如两性电解质，在pH＞等电点，带负电荷，相反则带正电荷。pH离等电点越远，所带电荷越多。另外，被分离质点的结构对电泳速度也有影响，如纤维状蛋白，比球状蛋白电泳速度快。