第一章化学生物学方法.ppt

（1）小分子微阵列检测 借鉴DNA芯片技术，人们发展了一种称为小分子印迹（small molecule printing）的技术，后来改称为小分子微阵列检测技术（small molecule microarrays，SMM）来筛选靶蛋白的小分子配体。小分子微阵列是一种新的高通量鉴定蛋白质结合的小分子配体的方法，有时又称为化学芯片。 小分子微阵列是一种具有1000-100000个探针部位对称排列整体的平面，每个探针部位可以含有通过共价或非专一性吸附固定化的小分子化合物（如多肽、糖、类药物分子、天然产物等）。 首先，将应用组合化学合成的小分子分别溶解在适当溶剂中，采用高精度的机器人将1nl含有每一种小分子的样品溶液精确定位点样于一块经过处理的载片上，所有的化合物都含有共同的连接反应官能团，可以通过共价键的形式将小分子固定在载玻片上，从而形成高密度的小分子阵列（1000个点/cm2）。 用荧光标记的蛋白质探出需要的小分子配体，在载玻片洗涤除去非专一性吸附的蛋白质后，可以通过扫描荧光斑点证实哪个小分子与蛋白质发生了较强的相互作用。在此基础上，这些小分子可以依次被多种标记的靶蛋白分别进行筛选。该方法选择性好，灵敏度高。 在小分子芯片（SMM）制备过程中，小分子的固定是极其关键的步骤，因为它决定了小分子以哪种方式与靶蛋白相互作用，也决定了在合成期间应该引入哪些化学基团以便得到均匀固定化的小分子。 目前，有多种方法用于构建小分子芯片，如共价固定、光活化交联和原位合成。 共价固定：Puskas 和他的同事们用丙烯酰化的和环氧化反应建立了六种可以共价固定化核酸、蛋白质和小分子的玻璃表面。他们使用树枝状化合物和三氨基连接体系增加了固定化的效率。这种方法可进一步应用于表面疏水性和亲水性的修饰，从而可以产生各种变化的表面有利于小分子芯片（SMM）的应用。 Waldmann等使用温和的条件建立了一种在芯片上具有化学选择性的连接方法，该方法由有机磷衍生的玻璃和带有叠氮化的分子构成。 光活化交联：Mrksich 等利用光活化后引发的D-A反应制备小分子芯片，首先他们将2-硝基-3,4-二甲氧基苯甲氧酰(NVOC)保护的氢醌固定在金包衣的玻璃表面，经过紫外照射，氢醌被活化，然后经化学的或电化学氧化形成对苯醌，再与环戊烯标记的配体反应。 原位合成：这是一种不经过小分子的固定化步骤，而是直接在芯片的玻璃上连续合成形成小分子的方法。如Kodadek等使用MeNPOC-保护的羟基乙酸和光活化偶联等步骤制备的小分子芯片。 （2）亲合层析技术 亲合层析技术是将小分子通过一个臂连接到固相介质，然后将蛋白质萃取液通过亲合层析柱，在某些情况下，靶蛋白被吸附在柱上。 靶蛋白被洗脱下后，可以通过质谱技术进行微量的顺序分析并根据遗传密码和遗传信息转译成基因顺序，这些方法要求蛋白质与小分子配体之间必须具有较强的亲和力，否则会存在问题而不可靠。 将小分子配体（L）通过一个连接臂固定到固体载体上，然后与含有目标靶蛋白（T）的蛋白质萃取液培育一定时间，通过一系列的洗脱步骤除去未结合的蛋白后，改变体系缓冲液的条件（如离子强度、pH等）将所有结合在亲和层析载体上的蛋白质洗脱下来，再用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳研究这些蛋白质的性质。为了减少非专一性结合蛋白的数量，可以采用固定一个没有活性的小分子配体类似物（A）同时进行亲和层析实验，电泳后进行比较；同时采用在蛋白质洗脱液中加入过量的游离配体方法，使目标靶蛋白先于有游离配体结合，而非专一性蛋白与固定化配体结合，洗脱后经电泳实验可以进一步排除非专一性蛋白。也可以采用系列层析技术，即在经过一次亲和层析后，再将其洗脱液与新的固定化配体培育，进行第二次亲和层析，洗脱后，经过电泳实验，并与第一次洗脱液的电泳图谱比较，最后确定小分子配体结合的蛋白质（图中箭头所指电泳条带）。 （3）噬菌体展示技术 噬菌体展示技术是将多肽或蛋白质的编码基因或目的基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下，使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达，融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。 展示在的噬菌体表面的多肽或蛋白与固定化的小分子配体经过一定时间孵育后，洗去未结合的游离噬菌体，然后以竞争受体或酸洗脱下与小分子配体结合吸附的噬菌体，洗脱的噬菌体感染微生物宿主细胞后经繁殖扩增，进行下一轮洗脱，经过3轮-5轮的“吸附-洗脱-扩增”后，与小分子配体特异结合的噬菌体得到高度富集，然后将该噬菌体表面展示的多肽或蛋白质进行鉴定，确定靶蛋白。 噬菌体展示技术示意图 （4）酵母三杂交系统 酵母三杂交系统(three-hybrid system)是近几年在酵母双杂交技术的基础上发展的由活性小分子鉴定靶蛋白的方法。其基本原理与酵母双杂