各种显微镜的讲义.doc

几种特殊的光学显微镜 （一）暗视野显微镜 ??????? 暗视野显微镜不具备观察物体内部的细微结构的功能，但可以分辨 0.004μm 以上的微粒的存在和运动。因而常用于观察活细胞的结构和细胞内微粒的运动等。暗视野显微镜的基本原理是丁达尔效应。 暗视野显微镜的基本使用方法如下： 1．安装暗视野聚光器（或用厚实的黑纸片制成遮光板，放在普通显微镜的聚光器下方，也能得到暗视野效果）。2．选用强光源，一般用显微镜灯照明，以防止直射光线进入物镜。3．在聚光器和玻片之间加一滴香柏油，避免照明光线于聚光镜上进行全反射，达不到被检物体，而得不到暗视野照明。4．进行中心调节，即水平移动聚光器，使聚光器的光轴与显微镜的光轴严格位于一直线上。升降聚光器，将聚光镜的焦点（图 2 中圆锥光束的顶点）对准待检物。5．选用与聚光器相应的物镜，调节焦距，按普通显微镜的方法操作。 （二）体视显微镜 体视显微镜又称实体显微镜或解剖镜，其成像为正立三维的空间影像，并具有立体感强、成像清晰宽阔、长工作距离（通常为 110 mm）以及连续放大观看等特点。生物学上常用于解剖过程中的实时观察（附图 13）。 普通光学显微镜的光源为平行光，因而形成的是二维平面影像；而体视显微镜采用双通道光路，双目镜筒中的左右两光束具有一定的夹角体视角（一般为 12o15o），因而能形成三维空间的立体图像。体视显微镜与普通光学显微镜的使用方法相近，但更为便捷。二者的主要区别在于： 1. 体视显微镜的镜检对象可不必制作成装片。2. 体视显微镜载物台直接固定在镜座上，并配有黑白双面板或玻璃板，操作者可根据镜检的对象和要求加以选择。3. 体视显微镜的成像是正立的，便于解剖操作。4. 体视显微镜的物镜仅一只，其放大倍数可通过旋转调节螺旋连续调节。 （三） 荧光显微镜 荧光显微镜是利用细胞内物质发射的荧光强度对其进行定性和定量研究的一种光学工具。细胞内的荧光物质物质有两类，一类直接经紫外线照射后即可发荧光，如叶绿素等；另有一些物质本身不具这一性质，但如果以特定的荧光染料或荧光抗体染色，经紫外线照射后亦可发荧光。 荧光显微镜的原理为利用一个高发光效率的点光源（如超高压汞灯），经 过滤色系统发出一定波长的光(如紫外光3650λ 或紫蓝光4200λ)作为激发光，激发标本内的荧光物质发射出各色的荧光后，再通过物镜后面的阻断(或压制)滤光片的过滤，最后经由目镜的放大作用加以观察。阻断滤光片的作用有二：一是吸收和阻挡激发光进入目镜以免干扰荧光和损伤眼睛；二是选择并让特定的荧光透过，表现出专一的荧光色彩。 荧光显微镜按照光路原理可分为两种： 1．透射式荧光显微镜 较为旧式的荧光显微镜，其激发光源通过聚光镜穿过标本材料来激发荧光。其优点是低倍镜时荧光强，而缺点是随放大倍数增加其荧光减弱。所以它仅适用于观察较大的标本材料。2．落射式荧光显微镜 激发光从物镜向下落射到标本表面，即用同一物镜作为照明聚光器和收集荧光的物镜(附图 1-5)。 光路中需加上一个双色束分离器（分色镜），它与光轴呈 45o 角，激发光被反射到物镜中，并聚集在样品上，样品所产生的荧光以及由物镜透镜表面、盖玻片表面反射的激发光同时进入物镜，返回到双色束分离器，使激发光和荧光分开，残余激发光再被阻断滤片吸收。如换用不同的激发滤片／双色束分离器／阻断滤片的组合插块，可满足不同荧光反应产物的需要。此种荧光显微镜的优点是视野照明均匀，成像清晰，放大倍数愈大荧光愈强。 （四）相差显微镜 ??????????相差显微镜是能将光通过物体时产生的相位差（或光程差）转变为振幅（光强度）变化的显微镜。主要用于观察活细胞、不染色的组织切片或缺少反差的染色标本。人眼只能鉴别可见光的波长（颜色）和振幅的变化，不能鉴别相位的变化。而大多数生物标本高度透明，光波通过后振幅基本不变，仅存在相位的变化。相差显微镜基本把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。光线透过标本后发生折射，偏离了原来的光路，同时被延迟了 1/4λ（波长），如果再增加或减少 1/4λ，则光程差变为 1/2λ，两束光合轴后干涉加强，振幅增大或减下，提高反差（见图 6）。 从结构上看，相差显微镜与普通光学显微镜不同之处在于： 1．环形光阑具有环形开孔的光阑，安装在光源与聚光器之间，作用是使透过聚光器的光线形成空心光锥，聚焦到标本上。2．相位板相差显微镜在物镜内部增加了涂有氟化镁的相位板，作用是将直射光或衍射光的相位推迟 1/4λ。相板上有两个区域，直射光通过的部分叫“共轭面”，衍射光通过的部分叫“补偿面”。相位板按工作效果分为两种类型：（1）A+相板：将直射光推迟 1/4λ，两组光波合轴后光波叠加，振幅加大，标本结构比周围介质更