2009生技基因工实验预习报告.docVIP

基因工程大实验技术路线： 目的基因获取；——→ 限制酶酶切；——→ 连接载体；——→ 转化受体；——→ 原核表达 实验设计： 设计引物——→ 聚合酶链式反应——→ 琼脂糖凝胶电泳检测——→ PCR产物胶回收，过柱纯化——→ 双酶切（PCR产物、质粒载体）——→ 酶切产物胶回收，过柱纯化——→ 连接反应——→ 转化感受态——→ 摇菌——→ 诱导表达——→ 检测 实验一 聚合酶链式反应 实验试剂：cDNA模板、上游引物、下游引物、10×Buffer、dNTP、Taq酶、ddH2O 实验用具：1.5mL Eppendorf管、0.2mL Eppendorf管、微量移液器、1mL 蓝吸头、200μL黄吸头、10μL白吸头、冰盒、PCR扩增仪、离心机 实验步骤： PCR反应体系（25μL） cDNA模板 1μL 上游引物 1μL 下游引物 1μL 10×Buffer 2.5μL dNTP 2μL Taq酶 0.125μL ddH2O 17.375μL 25μL PCR仪程序设置： 预变性 94℃ 5min 变性 94℃ 40s 退火 56℃ 45s 35 cycles 延伸 72℃ 45s 72℃延伸10 min 10℃ 16h 实验二 琼脂糖凝胶电泳 实验试剂：PCR产物、1%琼脂糖凝胶、TAE、Gold viewer、6×上样Buffer、DNA Marker 实验用具：1.5mL Eppendorf管、0.2mL Eppendorf管、微量移液器、1mL 蓝吸头、200μL黄吸头、10μL白吸头、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像系统 实验步骤： 1. 将制胶板水平放置在工作台上2．调整好梳子3．称取 g琼脂糖于 mL 1×TAE中，在微波炉中使琼脂糖颗粒完全溶解，冷却至oC时加入核酸染色剂Gold viewer，冷却至50oC时倒入制胶板中 4．凝胶凝固后，小心拔去梳子 5．将电泳槽中，加入×TAE电泳液，将样品与混合后将样品依次点入加样孔中 6．打开电泳仪，使核酸样品向正极泳动7．电泳完成后切断电源，取出凝胶后置于观察电泳结果，并记录。 实验试剂：带胶PCR产物、胶回收试剂盒 实验用具：1.5mL Eppendorf管、微量移液器、1mL 蓝吸头、200μL黄吸头、酒精灯、手术刀、离心机、凝胶成像系统 实验步骤： 1.从电泳板上切割含目的DNA片段的凝胶块(割胶尽可能的小)2.凝胶称重后并将其放入1.5ml管中,将其适当切小,加速溶解.每100mg凝胶加入400μl solution SN.(若称重省略,一般加入400μl SN)3.凝胶溶解:55-60,保温5-10分钟,每2分钟混匀一下,使凝胶溶解,胶完全融化后每400μl solution SN中加入solution B 100μl,混匀4.将3S柱装入2ml洗管,将上述混合液转移至3S柱,室温放置2min.室温10 000 rpm离心1分钟,稳定45秒取下3S柱,倒掉收集管中的废液,将3S柱放入同一收集管中,加入600μl Wash Solution,室温10 000 rpm离心1分钟重复步骤5一次取下3S柱,倒掉收集管中废液,将3S柱放入同一收集管中,室温10 000 rpm离心2分钟将3S柱放入新的离心管中,在3S柱子膜中央加30μl ddH2O,不加盖室温放置2分钟盖上离心管,室温10 000 rpm离心1分钟,离心管中的液体即为回收的DNA片段 实验试剂：限制酶EcoRⅠ、限制酶XhoⅠ、10×H Buffer 实验用具：1.5mL Eppendorf管、微量移液器、1mL 蓝吸头、200μL黄吸头、10μL白吸头、恒温水浴锅 实验操作：管1：1.5mL Eppendorf管，20μL反应体系 胶纯化产物 15μL 10×H Buffer 2μL EcoRⅠ 1μL XhoⅠ 1μL ddH2O 1μL 20μL 管2：1.5mL Eppendorf管，20μL反应体系 质粒Pet30a 15μL 10×H Buffer 2μL EcoRⅠ 1μL XhoⅠ 1μL ddH2O