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* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 双链DNA断裂（DSB) P768 双链DNA断裂（DSB) 不对称切割 P768 DSB单链末端的生成 Spoll-寡核苷酸释放前DSB末端切除的模型。 (a)利用前一步产生的缺口对两条链进行切除。 (b)两个重 组酶（Rad51和Dmcl）不对称地负载到新 3’产生的单链区域， (c) 其中一个蛋白质（蓝色）标注被紧密包裹的3’自由端，入侵一个同源 5’双螺旋，起始Holliday联接体的形成。 Chapter 24 Genomics、Proteomics and Bioinformatics 24.1 图位克隆（Positional Cloning） 图位克隆是一种发现遗传性状相关基因的方法，常用于鉴定人类遗传疾病相关基因。 在不知道突变蛋白特征的情况下寻找未知功能的基因。必须在人类遗传图谱上确定该基因的位置，这一过程就是图位克隆。 图位克隆策略源于研究家庭或家族性疾病，目的是寻找一个或多个与“疾病基因”紧密连锁的标记。 P805 疾病相关基因的鉴定 亨廷顿舞蹈症 亨廷顿舞蹈症( HD)是一种继发性神经系统紊乱疾病。这种病在发病初期是一些无意识的手脚不灵活和轻微的抽搐。随着时间的迁移，这些症状加剧并伴随情绪上的不稳定。 图位克隆的传统手段 限制性片段长度多态性 在20世纪后期，仅有少数人类基因被定位，因此，想定位一个邻近已知基因的新基因都很难。RFLP方法则不着眼于发现与已知基因连锁的新基因，而是将新基因与可能不含任何基因的一段“无名”DNA片段建立连锁，通过限制酶酶切图谱识别这些DNA片段。 P806 Detecting RFLPs P806 RFLP分析 多态性分析 单体型定位 确定基因 一旦某个基因被锁定在一段几十万碱基的区域内，如何将其从这段DNA中挑选出来呢？ 如果这段DNA尚未被测序，可以对其测序并寻找可读框(ORF)。可读框被翻译时，在相对较长的区域内不会遇到终止密码子。但寻找可读框还是件很费力的事，有几种更为高效的方法，其中包括Alan Buckler发明的称之为外显子扩增(exonamplification)或外显子捕获（exon trapping）的方法。 P806 外显子捕获（Exon Trapping） 步骤1：外显子（红色）已插入，两侧是自身部分内含子和自身5，剪接位点和3，剪接位点。 步骤2：将构建的载体转染COS细胞，COS细胞能转录插入片段，并对转录物进行剪接。注意插入的外源外显子（红色）由于带有自身5’剪接位点和3’剪接位点，因而在剪接过的转录物中保留下来。 步骤3和4：将转录物进行反转录和PCR扩增，引物为箭头所示。获得含有外来外显子的很多拷贝，可用于克隆和测序。 注意：非外显子没有剪接位点，与内含子一起剪除，不会留到步骤3中，因此无须浪费时间研究。 P807 利用RFLP，遗传学家将亨廷顿病相关基因HD定位到邻近4号染色体末端的一个区域，继而用外显子捕获法确定了该基因。 引起这种疾病的突变是基因中CAG重复序列从正常的11～34个拷贝增加到至少38个拷贝。这些额外的CAG重复序列导致额外的谷氨酰胺插入亨廷顿蛋白。 小 结 24.2 基因组测序 First genome sequenced was a very simple one, phage ?X174 Completed by Sanger in 1977 5375nt complete 噬菌体 ?X174基因组 P812 DNA 5375bp 编码197kD 9种基因产物 262kD 噬菌体?X174 测序结果 基因产物 分离结果 Note that some of these phage genes overlap 人类基因组计划 1990年，美国遗传学家决定着手一项艰巨的探索，对整个人类基因组进行作图并最终测序，即人类基因组计划(Human Genome Project)。 最初的人类基因组计划是系统而保守的。首先，遗传学家需要绘制基因组的遗传图谱和物理图谱，这些图谱包含一些标记（或称为路标），以便随后测出的序列能按正确顺序拼接。大规模测序只能在遗传图谱与物理图谱已经完成，且图谱中所有位点对应的克隆已经获得的情况下才能进行。最初预期整个测序计划全部完成的时间为2005年。 P815 人类基基因组计划 1998年5月，由Craig Venter创立的以营利为目的私人公司（Celera公司）着手对人类基因组和其他生物基因组进行测序，令基因组学界震惊的是该公司宣布将在2000年之前完成人类基因组草图。这一时间表已经非常惊人了，而更