现代生物技术(二)精读.pptx

人工基因组的设计与合成李炳志bzli@tju.edu.cn2013-041第七章 现代生物技术(二)李炳志bzli@tju.edu.cn2013-042第八章 现代生物技术(二)DNA重组技术聚合酶链式反应3DNA重组技术目的基因的获取克隆载体的构建外源基因与载体的连接（体外重组）重组DNA导入受体菌转化子的筛选和鉴定克隆基因的表达4载体载体(vector)是指能在连接酶作用下和外源DNA片段连接起来，并运送到宿主细胞的运载工具。其化学本质为DNA分子。5载体必须具备的基本条件⒈具有独立复制能力⒉具备多个限制酶的识别位点(多克隆位点)⒊具有遗传表型或筛选标记⒋有足够的容量以容纳外源DNA片段⒌可导入受体细胞。6多克隆位点ori复制起始点遗传标记Amppolylinker基因载体7载体的分类（一）克隆载体用来克隆和扩增DNA片段的载体。有质粒DNA、噬菌体DNA和病毒DNA三类。（二）表达型载体为了使插入的外源DNA能够表达为多肽链而设计的载体称为表达型载体。表达型载体除需载体必备条件外，还需相应的启动子、核糖体结合位点、增强子、终止子等表达调控构件。8质粒(plasmid) 是存在于细菌染色体外的、能自主复制的双链环状DNA分子。作为克隆载体的质粒应具备以下特点：1.分子量相对较小，能稳定存在于细菌体内，有较高的拷贝数；2.具有1个以上的遗传标志，便于筛选；3.具有多克隆位点。91、质粒是细菌染色体外能自主复制的环形双链DNA分子。2、质粒DNA在添加真核复制信号和启动子后，可以构建出能在原核和真核细胞中均可复制的穿梭质粒，并在真核细胞中表达，因此这类载体在基因工程中应用广泛。质粒的生物学特性真核复制子原核复制子103、根据每个寄主细胞中质粒拷贝数的多少，把质粒分为严紧型复制质粒（拷贝数少，为1-5个）与松弛型复制质粒（拷贝数多，可达10-200个拷贝）。因此，作为载体的质粒应该是松弛型的。4、质粒的不亲和性：两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。11pBR322质粒①4363bp②含一个复制点含一个抗氨卞青霉素基因(ampR)④一个抗四环素基因(tetR)⑤ampR和tetR抗性基因内各有一些限制酶的酶切位点，供外源基因插入;当外源基因插入抗药基因内后，抗药基因失活。AmpR→Amp敏感(AmpS)、TetR→Tet敏感(TetS).12抗药性标志的选择pBR322AmpTet插入片段Amp平板Tet平板13pUC系列质粒由pBR322和M13噬菌体构建而成的双链质粒载体；（1）2674bp；（2）有ampR和与M13噬菌体相同的多克隆位点（MCS）（3）有1个来自E.coli的LacZ基因片断,编码半乳糖苷酶，便于蓝白筛选14LacZ蓝白斑筛选（LacZ基因片段）插入片段（LacZ基因失活）LacZ基因片段LacZ酶1516底盘细胞（宿主）为外源元件与模块发挥功能提供底盘基架（类比汽车和计算机工程上的底盘），既维持细胞良好的生物系统功能，又为元件与模块的功能实现提供必要的能量和组分。天然底盘即宿主细胞通常指从实验技术上讲是能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞。17底盘细胞的特征便于重组DNA分子的导入；能使重组DNA分子稳定存在于细胞中；便于重组体的筛选；遗传性稳定高，易于扩大培养或发酵生长；安全性高，无致病性，不会对外界环境造成生物污染；有利于外源基因蛋白表达产物在细胞内的积累，或促进外源基因的高效分泌表达。在遗传密码的应用上无明显偏倚性；具有较好的翻译后加工机制，便于真核目的基因的高效表达；在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。18常见的天然底盘大肠杆菌：属革兰氏阴性菌，它是目前为止研究得最为详尽、应用最为广泛的原核生物种类之一，繁殖迅速、培养简便，代谢易于控制枯草芽孢杆菌：革兰氏阳性菌，具有胞外酶分泌－调节基因，能将表达的产物高效分泌到培养基中。在大多数情况下，真核生物的异源重组蛋白经枯草杆菌分泌后便具有天然的构象和生物活性。酿酒酵母：单细胞真核微生物，外源真核基因最理想的表达系统。具有真核生物蛋白翻译后修饰加工系统。蓝细菌：作为表达外源基因的受体菌兼具微生物和植物的优点。遗传背景简单，便于基因操作。19重组DNA的转入转化：重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程称之为转化。感受态细胞（competentcell）：通过理化方法诱导而处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态的细胞。大肠杆菌常见转化方法：Ca2+诱导转化法电穿孔转化法20（1）Ca2+诱导的大肠杆菌转化法21（2）电穿孔转化法基本原理：利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔(electroporation)．形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的有效吸收。示意图