4沉淀法.pptVIP

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 生技 * * * * * * zhou2 * * * * * * 生科 * * * * * * * * 1、分段盐析法分离酵母醇脱氢酶 过滤液经过30%丙酮沉淀杂蛋白后，然后进行分段盐析 分段盐析法分离酵母醇脱氢酶 丙酮沉淀杂蛋白后粗酶的比活上升4.94倍． 分段盐析中饱和度在50％～55％区段中析出的组分与粗酶相比其比活上升9.62倍， 工艺优点： 丙酮沉淀杂蛋白后，再加大丙酮浓度使粗酶沉淀的过程,如果不在低温下逐滴加入冷丙酮，酶活力极易丢失． 而盐析中，硫酸铵的加入会稳定蛋白质的构象，使之难于变性,所以在分段盐析中酶的总活力很少丢失． 分段盐析可以多次重复进行，以便纯化倍数提高．但有机溶剂沉淀法易使蛋白质变性，不易反复使用． 2．尿激酶的沉淀分离 尿激酶：分离方法包括沉淀法、吸附法、层析法 沉淀法： 金属离子形成复合盐 脱盐 盐析 Zn 离子沉淀尿激酶 低浓度时，zn 能选择沉淀尿激酶。在3mM可得85-92 回收率，而沉淀物的量并不多； 加大Zn 浓度虽然能提高有限回收率，但沉淀物量大，纯度降低。 沉淀量 酶活 EDTA 溶出效应 硫酸铵替代EDTA 将20g／L硫酸铵(氨水调pH)按1:4溶出UK 尿激酶等电点9.5 硫酸铵溶解尿激酶锌络合物 硫酸铵的选用 1)它在低浓度时可能有盐溶作用，促进沉淀蛋 白溶解； 2)因为本身有NH4+，与Zn 2+有络合作用，有 利于沉淀物溶解； 3)硫酸铵为盐析所用，在最终盐析中，只需补 加规定量即可，而不引入其他成分。 尿激酶盐析沉淀 沉淀量 回收率 纯度 目前国际上通用的血浆蛋白分离方法是采用传统的低温乙醇工艺，此工艺经多方验证和几十年的临床实践证明是安全、有效的。 利用乙醇的低介电常数性质以及不同蛋白质在一定温度、pH、离子强度及浓度下在不同浓度乙醇中溶解度不同来分离血浆蛋白，生产出多种血浆医用蛋白，成为著名的Cohn乙醇沉淀法 可将血浆蛋白分离为Ⅰ～Ⅴ个组分。常利用Ⅰ(纤维蛋白原)、Ⅱ(免疫球蛋白)、Ⅴ(白蛋白)3个组分。 3.利用沉淀法大规模提纯血浆蛋白 利用沉淀法提纯白蛋白与免疫球蛋白 血浆 PH6/Pr5% I0.14 /T-4/E20% 过滤 过滤液IV 沉淀I+II+III 滤液IV 沉淀 (I+II+III) PH6/Pr2.4% I0.09 /T-5/E40% 过滤 沉淀 滤液V PH4.8/Pr1.2%/ I0.09 T-7/E40% 沉淀V(白蛋白) 滤液 过滤 PH5.2/Pr1.0% I0.01 /T-4/E14% 过滤 沉淀 滤液 PH7.1/Pr0.4%/ I0.05 T-6/E25% 沉淀II(球蛋白) 滤液 过滤 4. 胰蛋白酶的提取 从动物胰脏中提取胰蛋白酶工艺 胰蛋白酶原的溶解：酸性条件下稳定 溶解液中含有大量的酸性杂蛋白（pI10.8) 浓缩分离胰蛋白酶原（盐析） 溶解激活（酶原-酶） 胰蛋白酶的进一步分离：酶溶液中糜蛋白弹性蛋白等与胰蛋白酶在不同的盐浓度下溶解度不同 胰蛋白酶的提取 （二）胰蛋白酶原激活 滤饼溶解, 加入无水CaCl2,边加边搅拌,最终含有0.1M CaCl2； 5MNaOH调pH至8.0,加极少量胰酶搅拌，于室温下活化8～10小时； 活化完成，用2.5M H2SO4调pH至2.5-3.0，抽滤除去CaSO4沉淀。 （一）猪胰蛋白酶原的提取 胰脏绞碎加入2倍体积冷乙酸 (pH2.5)低温搅拌24小时，过滤； 滤液用2.5M H2SO4调pH至2.5～3.0，放置3～4小时后，用滤纸过滤； 滤液加入硫酸铵,达0.75饱和度放置过夜抽滤，得酶原粗制品。 （三）胰蛋白酶的分离 将激活溶液加入固体硫酸铵,达0.4饱和度,数小时后抽滤弃滤饼。 滤液加入硫酸铵，饱度达到0.75，放置数小时，抽滤弃滤液，即得胰蛋白酶粗品。 5.　柠檬酸的生产 柠檬酸是一种重要的有机酸，它在食品、医药、化工、皮革、环保等工业部门都有广泛的用途。 目前柠檬酸极大多数是通过微生物发酵法（黑曲霉）生产， 提取工艺中，目前大多通过沉淀法制备（碳酸钙沉淀及硫酸酸解） CH2 — COOH HO —CH2 — COOH CH2 — COOH 标准沉淀法回收柠檬酸流程图 加热到70度 pH1.8~2.0 过滤 柠檬酸提取新工艺的主要种类 钙盐法因工艺成熟、设备简单、原材料易得和产品质量稳定等特点而在国内外被广泛使用。 缺陷：单元操作多，总收率低；消耗化工原料多，固液分离能耗高；环境污染严重。 我国近几年