酶的测定方法.docVIP

一、脲酶测定(比色法) 1、试剂配制： pH6.7柠檬酸盐溶液：取368g柠檬酸溶于600mL蒸馏水中，另取295g氢氧化钾溶于水，再将两种溶液合并，用1N氢氧化钠将pH调至6.7，并用水稀释至2L。 苯酚钠溶液：称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2mL甲醇和18.5mL丙酮，后用乙醇稀释至100mL（A液），保存再冰箱中。称取27g氢氧化钠溶于100mL水中（B液），保存于冰箱中。使用前，取A、B两液各20mL混和，并用蒸馏水稀释至100mL备用。 次氯酸钠溶液：用水稀释制剂至活性氯的浓度为0.9％，溶液稳定。 10％尿素溶液：10g尿素溶于100mL水中。 N的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水稀释至1L，则得1mL含0.1mgN的标液，再将此液稀释10倍制成氮工作液（0.01mg/mL）。 2、操作步骤 称取5ｇ土置于50mL容量瓶中,加1mL甲苯处理,加塞塞紧轻摇15ｍｉｎ;往瓶中加入5mL10%尿素液和10mL的柠檬酸盐缓冲液(ｐＨ6.7),仔细混匀。在37℃恒温箱中培养24ｈ。然后用热至38℃的蒸馏水稀释至刻度(甲苯应浮在刻度以上),摇荡,将悬液过滤。取滤液1mL置于50mL容量瓶中,用蒸馏水稀释至10mL,然后加入4mL苯酚钠溶液,并立即加入3mL次氯酸钠溶液，加入每一试剂后,立即将混合物摇匀,20ｍｉｎ后,将混合物稀释至刻度,在波长578ｎｍ处测定吸光值。脲酶活性以样品所得的吸光值减去对照样品吸光值之差,根据标准曲线求出氨态氮量。 标准曲线绘制：分别取0、1、3、5、7、9、11、13mL氮工作液置于50mL容量瓶中，加蒸馏水至20mL，再加4mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液，随加随摇匀，20min后显色，定容。1h内再分光光度计上于578nm处比色。 3、结果计算 以24小时后1g土壤中NH3－N的质量（mg）表示脲酶活性（Ure） Ure＝a·V·n/m 式中：a为由标准曲线求得的NH3－N浓度（mg/mL）；V为显色液体积（50mL）；n为分取倍数；m为烘干土重（g）。 土壤脲酶活性测定（NH4+释放量法） 脲酶是酰胺水解酶的一种，在自然界中分布广泛，植物、动物和微生物细胞中均含有此酶。土壤中的脲酶主要来源于微生物和植物。脲酶催化尿素的水解反应： 在反应过程中，氨基甲酸盐是中间产物。脲酶还能够催化羟基脲、二羟基脲、半卡巴脲等化合物的水解。脲酶含有镍，分子量在151，000 Da～480，00 Da之间。能够抑制脲酶活性的化合物有含硼化合物、尿素衍生物、甲醛、原子量大于50的重金属的盐、含氟化合物、醌和多元酚、抗代谢剂、杂环硫醇等。 1. 试验原理 通过对新鲜土壤与尿素溶液在37℃培养2h后测定氨释放量，估计脲酶的活性 (Tabatabai, 1994)。 2. 试验仪器 50mL容量瓶；培养箱或恒温水浴；蒸馏定氮仪。 3. 试验试剂（所用试剂均为分析纯） a. 甲苯（C6H5CH3）; b. 缓冲液：三（羟甲基）氨基甲烷[c（C2H8O3N3）=0.05mol·L-1, pH9.0]：称取6.1g三（羟甲基）氨基甲烷（Tris (hydroxymethyl) aminomethane）溶入700mL蒸馏水中，用c（H2SO4）=0.2mol·L-1的硫酸溶液调pH至9.0，再用蒸馏水定容至1000mL; c. 尿素溶液{c[CO(NH2)2]=0.2 mol·L-1}：称取1.2g尿素溶入约80mL缓冲液中，后用该缓冲液定容至100mL。尿素溶液要当天配制，并在4℃下保存备用； d. 氯化钾硫酸银混合溶液[c（KCl）＝2.5mol·L-1]－[ρ（Ag2SO4）=100mg·L-1] Ag2SO4溶于700mL蒸馏水中，再加入188g的KCl（分析纯）使之溶解，在定容至1000mL； e. 氧化镁（MgO）：于高温电炉中，将氧化镁在600℃-700℃温度下灼烧2h，再放置于干燥器中冷却，贮于瓶中； f. 混合指示剂：溶解0.099g的溴甲酚绿和0.066g甲基红于100mL的乙醇（95％纯度）中； g. 硼酸指示剂溶液[ρ（H3BO3）=20g·L-1][c(NaOH)=0.1mol·L-1],直至溶液呈红紫色（pH约4.5），稀释成1L； h. 硫酸标准溶液[c（1/2H2SO4）mol·L-1]。 4. 试验步骤 将5.00g新鲜土样（2mm）放置于50mL容量瓶中，加入0.2mL甲苯（试剂a）和9mL缓冲溶液（试剂b），轻摇混匀后加入1.0mL尿素溶液（试剂c），再次轻摇混匀并塞上瓶塞。在37℃下培养2h。然后加入约35mL的KCl-Ag2SO4溶液（试剂d），轻摇容量瓶几秒钟后，放置至室温（约5min），用KCl-Ag2SO4