细胞工程核移植技术与动物克隆mdf案例.pptVIP

第8章 核移植技术与动物克隆 学习须知 主要内容：细胞核的移植技术及其应用。 重点：核移植的操作程序及其应用。 难点：核移植的操作程序 核移植技术的含义 核移植技术就是利用显微操作技术将供体细胞核的细胞核移植到另一个细胞中（同种或异 种动物的去核成熟卵细胞），使后者不经精子穿透等有 性过程即可被激活、分裂并发育,使得核供体的基因得到 完全复制，经过体外培养，把重组的克隆胚胎移植到代孕母体内，最终从而创造无性杂交生物新品种的一项技术。发育为含有与供体细胞相同遗传性状的新个体。 8.1 核移植技术 8.1.1 技术种类 8.1.2 一般操作程序 8.1.1 技术种类 以供体核的来源不同可分为： 胚细胞核移植； 体细胞核移植； 干细胞核移植 胚胎克隆：使用的核供体细胞如果来自多细胞阶段的胚胎，叫做胚胎克隆。 体细胞克隆：使用的核供体细胞来自动物体，叫做体细胞克隆。 1、胚胎细胞核移植 （Embryo cell nuclear transplantation）: 又称胚胎克隆，是通过显微操作将早期胚胎细胞核移植到去核卵母细胞中构建新合子的生物技术. 通常把提供细胞核的胚胎称核供体，接受细胞核的称受体。 由于哺乳动物的遗传性状主要由细胞核的遗传物质决定，因此由同一枚胚胎作核供体通过核移植获得的后代，基因型几乎一致，称之为克隆动物。 通过核移植得到的胚胎可作供体，再进行细胞核移植，称再克隆。在理论上，一枚胚胎通过克隆和再克隆，可获得无限多的克隆动物。 2、体细胞核移植 （Somatic Cell nuclear transplantation）: 　　又称体细胞克隆，即把体细胞移入去核卵母细胞中，使其重组并能发育为新的胚胎，这个胚胎最终发育为动物个体。用体细胞核移植方法获得的动物也称为克隆动物。 　　由于体细胞高度分化，恢复全能性困难，体细胞核移植的原理即是细胞核的全能性。 8.1.2 一般操作程序 1、受体细胞的获得及其去核； 2、供体核的获得 3、细胞核移植 4、卵母细胞激活 5、重组胚的培养 6、重组胚的移植 1、受体细胞的获得及其去核 　　作为细胞核移植的受体细胞主要有三类：去核的卵母细胞、受精卵和2-细胞胚胎，其中卵母细胞应用最为广泛。 卵母细胞的来源：一是对母畜进行超数排卵处理，从输卵管获取；二是屠宰母畜后获得。 受体细胞的去核 盲吸去核法 1983年McGrath和Soher在小鼠核移植中创立此法。先用细胞松弛素B等细胞骨架抑制剂处理卵母细胞。然后用固定管在第一极体对面吸住卵母细胞，将去核针刺穿第一极体附近的透明带，吸出第一极体及其附近的适量胞质，即完成去核。 该法的不足在于造成胞质流失和一些重要因子的丢失，从而影响到核的重编程和重构胚的后续发育，此外还给卵母细胞带来机械损伤。 末期去核法 以往卵母细胞去核均在减数分裂的MⅡ期进行，而Bordignon(1998)却在牛卵母细胞成熟30h后，用酒精激活，使其排出第二极体，然后去掉第二极体和附近的少量胞质 。 半卵法 此法由Willadsen(1986)在绵羊上创立。 先用固定管在第一极体对面固定卵母细胞，再用玻璃针在极体上部做一切口，然后用平口去核管沿切口插入，吸出第一极体及附近胞质，吸出量为总量1／2，用不含极体的一半进行核移植。虽然这种方法可以保证100％的去核率，但由于胞质减半，严重影响到胚胎发育。 化学诱导去核法 　　其机理是在极体排出阶段，采用干扰染色体分离或纺锤体功能的化学试剂，使所有染色体与纺锤体牢固结合同时蛋白合成抑制剂抑制细胞周期蛋白B合成，降低促成熟因子浓度，极体借助于惯性将染色质和纺锤体带出胞外，达到去核的目的。 化学去核法程序简单、机械损伤小、胞质丢失少、重复性好、适合大规模卵母细胞去核，具有很乐观的应用前景。 2、供体核的获得 　　供体核可以是早期胚胎细胞、胚胎干细胞和体细胞。 胚细胞 ：用0.2％链霉蛋白酶预处理胚胎，溶去胚胎的胶膜及透明带，分离出单个卵裂球。 体细胞：发现休眠(G0)的颗粒细胞核与去核MⅡ期卵母细胞构成的体细胞重构胚，其发育率及产生克隆后代的能力远高于其它类型的休眠体细胞 。 3. 细胞核移植 在显微操作仪操纵下，用一直径接近卵裂球大的移植针吸取一枚分离出的完整卵裂球，注入去核的受体卵母细胞的间隙中。 根据移入的部位不同，可分为透明带下注射和细胞质内注射。 胞质内注射是用一个外径5～8μm 的注核针吸取供体核后直接注射进卵母细胞胞质内的方法。透明带下注射则是把供体细胞核注射在透明带与卵母细胞之间的卵周隙中，核移植后用电刺激进行细胞融合。 4.卵母细胞的激活 其激活原理是通过电刺激、钙离子载体等方法，使卵母细胞从MII期中解放出来，并转到“受精”的状态。 核移植过程