分子生物学实验分析.docVIP

实验一 分子生物学基本实验操作 一、实验目的 通过本次实验、了解并掌握分子生物学实验中常用仪器的使用要领及注意事项，并掌握基本实验操作。 、实验材料及用品 超净台、摇床、超声波细胞破碎仪、紫外投射仪、移液枪及枪头、离心机、摇床等、实验要求超净工作台高压蒸汽灭菌锅高速离心机移液器的使用要领四、实验步骤 （一）了解分子实验室规则和安全知识； （二）介绍或演示常用实验器材及设备操作要领：Eppendorf管、ParafiLm、移液枪及枪头、离心机、PCR仪、紫外可见分光光度计、超声波细胞破碎仪、摇床及培养箱、超净台、紫外投射仪及紫外凝胶成像系统、制冰机、灭菌锅 （三）常用溶液及试剂配制； （四）常用实验材料大肠杆菌菌种的保藏与活化方法。 六、思考题 实验二 质粒DNA的提取和纯化 E.coLi DH5?（pET28a-NK）一、实验目的 通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒的原理和技术方法 、实验材料及用品 台式离心机、移液枪及枪头、制冰机、预冷无水乙醇、E.coLi DH5?（pET28a-NK）、裂解液I、II、III、TE缓冲液（含RNase） 、实验原理 质粒DNA尚在上清中，。 、实验步骤 1、取1mL 过夜培养物于1.5mL EP 管中，12000 rpm 离心2，弃上清保留菌体； 2、将沉淀重悬于100uL预冷的裂解液I中，充分混匀，室温放置5分钟； 3、加200uL新鲜配制的裂解液Ⅱ，轻轻混匀几次，冰浴3 分钟； 4、加150uL预冷的裂解液III，轻轻混匀几次，冰浴5分钟；5、12000 离心10分钟，小心吸取350uL上清液于新的1.5mLEP中，加入预冷无水乙醇、混匀，室温放置15分钟； 6、12000 离心10分钟，弃上清，观察管底，除尽残余乙醇； 7、培养箱烘干或自然晾干，得DNA干品； 8、将DNA沉淀溶于20uLTE缓冲液或无菌水中，使DNA充分溶解，-20℃保存备用。 、记录并分析步骤2、3、4的现象和原因。 、实验要求注意事项1、对存放时间较长的菌种需要事先加以活化； 2、细菌培养过程要求无菌操作。抗菌素等不能高温灭菌，应过滤除菌。细菌培养液、配试剂用的蒸馏水、试管和离心管等有关用具和某些试剂经高压灭菌处理； 3、制备质粒的过程中，所有操作必须暖和，不要剧烈振荡，以避免机械剪切力对DNA的断裂作用同时也应防止DNase引起DNA的降解； 4、溶液II不可冷冻，现用现配，若出现沉淀则温热后再用；加入溶液II后动作要轻柔，不要剧烈振荡，只需轻轻颠倒几次离心管，既保证细菌沉淀在试剂中充分扩散又要避免机械剪切已变性的质粒DNA和染色体基因组DNA；放置时间不能过长，一般是5分钟，因为在此碱性条件下染色体DNA片段会慢慢断裂； 5、现场记录实验现象并分析原因。 实验三 琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA 一、实验目的 通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的原理和技术方法 、实验材料及用品 电泳仪、紫外检测仪、水平电泳槽、移液器、一次性手套、琼脂糖、TAE缓冲液、溴酚蓝染色剂、EB染色液、质粒pET28a-NK 、实验原理 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA在碱性的溶液中带有负电荷，因此，在电场作用下朝正极移动。在琼脂糖凝胶中电泳时，由于琼脂糖凝胶具有一定孔径，长度不同的DNA分子由于所受凝胶的阻遏作用大小不一，迁移的速度不同，从而可以按照分子量大小得到有效分离。溴化乙锭可插入到DNA分子的双链中。在紫外光的照射下，插入溴化乙锭的DNA呈橙红色荧光，所以溴化乙锭可以作荧光指示剂指示DNA含量和位置。 、实验步骤 1、琼脂糖凝胶的制备 称取g琼脂糖，放入锥形瓶，加入mL 1*TAE缓冲液，加热至完全融化，取出摇匀。 2、胶板的制备 （1）将有机玻璃内槽洗干净，晾干，两端用透明胶带粘住，并放好样品和梳子； （2）待胶液冷至60度左右时，加入1滴EB，轻轻混匀，将胶液缓缓倒入有机玻璃内槽；（3）待胶凝固后，拔掉梳子、撕掉胶带，放入电泳槽，液面将其没过； 3、加样 DNA样品中加入1-2?L溴酚蓝染色液，混匀后用移液枪上样。 4、电泳 （1）接通电泳槽与电泳仪电源，5V/cm； （2）当溴酚蓝染料移动至距凝胶前沿1-2cm处，停止电泳。 5、观察结果 用凝胶紫外成像仪观察结果。 、记录在实验报告上。 本实验应注意什么？影响DNA分子在琼脂糖介质中迁移的因素有哪些？EB染液及各有何作用？、实验要求注意事项1、EB为强诱变剂，操作时带手套； 2、电泳操作区为EB污染区，触摸过污染区的手套不要接触洁净区； 3、若用电炉溶化琼脂糖时，务必将盛放琼脂糖溶液的三角瓶放在石棉网上加热； 4、为防止溶化琼脂糖时溶液溢出瓶外，需在瓶口封盖铝箔； 5、制作胶板时，务必封好两端，以免漏胶； 6、向胶板内槽中安