第四讲酶催化、生物催化与微生物程序.ppt

* （1）用细粉末状的固体投料。这样可使转化细胞和粉末底物之间有最佳的接触面积。若要转化气体状态的碳氢化合物(如甲烷)，以气泡形式从底部通气，使泡慢慢通过转化培养基来增加相互接触面积，获得良好的转化效果。 * （2）利用非毒性表面活性剂 利用非毒性表面活性剂如吐温80类也能分散不溶性底物，增加转化细胞和底物相间接触。 * (3) 利用无毒性溶剂 如95%乙醇、丙酮、N,N-二甲基甲酰胺和二甲亚砜等来溶解底物，这是较理想的办法；但是这类有机溶剂在水中的溶解度很大，且底物浓度很高，因此每次添加的量应尽量的少，最好在添加底物前测定该有机溶剂的忍耐度。 * 另外，在培养菌丝体和转化过程中的适当阶段，有时另加诱导物，促进剂或抑制剂来促进酶的生成，提高酶的转化活力或抑制副反应产生。 * 5 产物的检测与分离纯化 在生物转化过程中底物的减少或产物的增加可采用薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)或气相色谱法(GC)等分析技术进行鉴定。 * 根据分析结果可以随时判断生物转化进行的程度，确定底物的最高转化率和产物的收率等，得出生物转化反应的最佳条件。 * 产物的分离纯化一般先将微生物细胞与转化液相分离，常采用抽滤或离心法（固定化细胞转化法则可省去此步骤）。 然后用有机溶剂从滤液中萃取转化产物，若为非中性产物则应调节溶液pH值，以提高萃取效率。 * 虽然生物转化产物绝大多数存在于转化液中，但在菌丝体中也会残留一些，因此很有必要用有机溶剂对菌丝体萃取1~2次，以提高转化产物的收率。 * 真菌类转化产物的分离一般先采用离心或抽滤法将菌丝体与转化液相互分离； 但细菌类转化产物的分离一般则不需要采用分离步骤，可直接用有机溶剂萃取产物。直接用有机溶剂萃取可能会导致产物中含有少量细胞组分。 * 萃取所得粗品需进一步的分离纯化才能得到纯品。 常用的精制方法有重结晶、柱层析法和色谱法等。 * 6 对映体过量 有机合成中常用化学产率(yield)来描述有机合成反应的实验结果，产率是指实际产量与理论产量的百分比。 而对于手性合成则既要考虑化学产率，又要考虑光学产率。 * 对映选择性是酶催化反应的重要特性。反应的对映选择性和非对映选择性程度可以用高、中、低来定性描述，用对映体过量(enantiomerjc excess，e.e.)则可以定量描述反应的对映体选择性。 * 对映体过量率是指反应后主要对映体产物的过量百分数，描述一个对映体对另一个对映体的过量率，通常用分数来表示，计算公式为式： * 相应地，非对映体组成可描述为非对映体过量(diastereoisomeric excess，d.e.)，它指一个非对映体对另一个非对映体的过量，计算公式为 式中[ ]表示摩尔分数 * 目前主要采用三种分析方法： a. 旋光法 b. 手性色谱法 c. NMR法 * a. 旋光法 手性分子的每个对映体都可使偏振光旋转到一定的角度，其数值相等但方向相反。因此，如果一个对映体的量超过另一个，产物就可能有光学活性。 * 可用实验测定旋光值，计算两个对映异构体混合物中一个对映体所占的百分数，即e.e.=([α]观察／[α]最大)×100％。该方法简便，无需预处理样品，其局限性是必须在实验前预先知道纯对映体的比旋光度[α]最大。 * b. 手性色谱法 它是测定对映体组成的最有效的方法之一，色谱固定相或流动相中的手性介质能将对映体直接或间接地完全分离。从而确定各对映体的组成。该方法的缺点是手性柱或手性试剂价格昂贵。 * c. NMR法 在手性溶剂、手性衍生化试剂或手性位移试剂作用下，对映体分子间1H、13C或31P、19F的化学位移不同，据此可以测定各对映体的组成情况。 * 谢谢！ * 1 生物催化剂的来源与制备方法 离体酶主要来源于动物、植物、微生物等的含酶细胞、组织或器官，通过提取法可制得多种离体酶。 * 例如，从动物胃中提取分离胃蛋白酶；从动物胰脏中提取胰蛋白酶、胰淀粉酶、胰脂肪酶，或这些酶的混合制剂胰酶；从动物血液中提取超氧化物歧化酶（SOD）；从木瓜中提取木瓜蛋白酶；从波萝中提取波萝蛋白酶；从大肠杆菌中提取谷氨酰胺酶等。 * 完整细胞主要来自于微生物，通过微生物发酵法来制备各种含酶细胞。例如以酿酒酵母为菌种进行发酵，可得到含有丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶等多种酶和辅酶的酵母细胞。 * 有机合成中所用的酶一般为粗品，其酶含量仅有1％～30％，其余是无活性的蛋白质、稳定剂、盐或者含有提取过程中混杂进来的多糖。酶的粗品比纯品更为稳定，但粗酶催化反应的副产物多。随着蛋白质分离纯化技术的发展，生物催化反应中纯酶的使用正在逐步增加。 * 2 微生物转化实验过程 微生物转化实验的简要过程如下： 选择菌种→成熟菌丝或孢子的培养→选择适当的转化方式