大肠杆菌感受态细胞的制备和转化技术范本.pptVIP

* * * * * * * * * 分子生物学 2008 实验 分子生物学 2008 实验 2010 实验九，十大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需将对数生长期的细菌（受体细胞）经理化方法处理后，细胞膜的通透性发生暂时性改变，成为能允许外源 DNA 分子进入的细胞，称感受态细胞。 一. 实验原理 1. 概念 感 受 态 细 胞 转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。 转 化 转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体,它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。 受体细胞经过一些特殊方法(如物理制备法,化学制备法等)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。 进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。 将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA分子的受体细胞)。 转 化 转化过程 KCl法， CaCl2法，电击感受态制备等 RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，但制备较复杂，不适合实验室用 电击感受态细胞转化效率高，操作简便，但需电击仪 CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃以下保存半年，因此CaCl2法使用更为广泛. 常用的感受态细胞制备方法 CaCl2法是以Mendel和Higa（1970）的发现，其基本原理是：细胞处于 0 ～ 4 ℃， CaCl2 低渗溶液中，大肠杆菌细胞膨胀成球状。转化混合物中的 DNA 形成抗 DNA 酶的羟基 - 钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经 42 ℃ 90 秒热激处理，促进细胞吸收 DNA 混合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型，如卡那霉素耐药基因得到表达，然后将此细菌培养物涂在含卡那霉素的选择性培养基上，倒置培养过夜，即可获得细菌菌落。 CaCl 2 法制备感受态细胞原理 提高转化效率的几个因素 细胞生长状态和密度 质粒的质量和浓度 试剂的质量 防止杂菌和杂DNA的污染 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5α菌株的OD600 为0.5时,细胞密度在5×107 个/ml左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。 提高转化效率的几个因素 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。1ng的cccDNA即可使50μl 的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。 提高转化效率的几个因素 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的,并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处 防止杂菌和杂DNA的污染： 整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管, tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染, 否则均会影响转化效率或杂DNA的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。  提高转化效率的几个因素 1）材料　　E. coli DH5α菌株； 质粒、 1.5ml 离心管（又称eppendorf管） 卡那霉素； 2）设备 　　恒温摇床，电热恒温培养箱，台式高速离心机，超净工作台，低温冰箱，恒温水浴锅，制冰机，分光光度计，微量移液枪， eppendorf管等。  二. 材料，设备及试剂 0.1mol/L的CaCl2 LB液体培养基 LB固体培养基 Kana母液：卡那霉素(Kanamycin )母液：配成 100mg/ml水溶液, -20℃保存备用 　　 3. 试 剂