蛋白质3-09技术范本.ppt

交联葡聚糖（Sephadex）; 聚丙烯酰胺凝胶 （Bio-Gel P ，） 琼脂糖凝胶（Sepharose，Bio-Gel A） 3 层析 1） 凝胶过滤法层析 交联葡聚糖（Sephadex） 2） 离子交换层析法： 离子交换纤维素： 离子交换交联葡聚糖：兼有分子筛效应 离子交换交联琼脂糖： 交联葡聚糖离子交换剂 3） 疏水层析 层析介质：苯基琼脂糖（phenyl-sephadex) 辛基琼脂糖(octa-sephadex) 洗脱： 低盐高PH 非离子型去污剂（triton x-100) 脂肪醇（丁醇、乙二醇） 4） 亲和层析 配基： 酶的底物、辅酶、抑制剂、效应物及其结构类似物，激素 与受体蛋白，抗原与抗体，生物素与亲和素（抗亲和素蛋 白），凝集素。 ◆ 免疫亲和层析 ◆ 凝集素亲和层析 ◆ 金属螯和层析 ◆ 染料配体层析 半透膜阻留pr分子，而让小的溶质分子和水通过，以达到除去蛋白质溶液中小分子（盐、低分子酸等）。 4 透析和超滤法 施以一定的压力使小分子溶质通过一半透膜，而按半透膜的筛孔大小截留相应的蛋白质分子 5 电泳和等电聚焦法： 普通电泳、等电聚焦、双向电泳、脉冲电泳、毛细管电泳 从电泳结果分：自由界面电泳、区带电泳、盘状电泳 从装置上分：圆盘电泳（柱状）、水平板电泳、垂直板电泳。 从支持物分：自由界面电泳、纸电泳（或薄膜电泳）、凝胶电 泳（PAGE ，琼脂糖胶，淀粉胶等） 等电聚焦 等电聚焦电泳法测定蛋白质pI 垂直平板电泳 6 保存 保存方法： ① 晶体保存： 结晶过程本身也伴随着一定程度的提纯。能否结晶不仅 是纯度 的一个指标，也是判断制品是否有活性的指标。 纯度越高，溶液越浓，越容易结晶。 结晶方法：使溶液略处于过饱和状态。降低温度、盐析、 加有机溶剂、调节pH、接入晶种。 ② 冻干粉保存： ③ 溶液保存： 加入抗冻剂（50%甘油）后-20~-70℃保存。 六 蛋白制品的含量分析、纯度鉴定与活性分析 （一） 含量分析 总蛋白含量分析： 凯氏定氮法、Folin-酚法（Lowry法）、双缩脲法、 考马斯亮蓝法、紫外吸收法 特定蛋白组分的含量分析： 酶和激素等：酶活性或激素活性表示（比活性） 其它蛋白：抗原抗体反应(western blot) MOV : MCB4.0 \ IMMUNOBLOTING （二）纯度鉴定（均一性） 基本手段： ◆ 电泳分析：单条带。 ◆ N端测定：n亚基蛋白有1-n个N端aa。 选用手段：沉降分析、溶解度分析 结晶分析（能结晶的一般比较纯，具有活性） 其它鉴定工作： 1）分子量的测定 2）等电点测定 3）C-末端AA的测定（肼解法） 4）分子中糖链 ① 血球凝集反应； ② 糖蛋白电泳（甲苯胺兰、R山兰、schiff试剂）； ③ 糖组分分析（层析、液相色谱） 5）含脂成分 苏丹黑预染、电泳。 6）光吸收 全波长扫描。找出它的吸收峰位置和最大吸则。 7）AA组分分析 （三）活性分析 蛋白质的性质和分离纯化 肌红蛋白晶体 第一节 蛋白质的理化性质一 蛋白质分子的大小和形状 测分子量的方法： ★化学组成法测定最低分子量 ★SDS法 ★凝胶过滤法 ★渗透压法 ★扩散系数法 ★沉降系数法和沉降平衡法 葡聚糖凝胶过滤法分析蛋白质分子量 SDS—PAGE （十二烷基硫酸钠—— 聚丙烯酰胺凝胶电泳） 二 两性解离性质及等电点 pH = pI 净电荷=0 pH pI 净电荷为正 pH pI 净电荷为负 Pr COOH NH3+ + H+ + OH- + H+ + OH- Pr COO- NH2 Pr COO- NH3+ 当蛋白质溶液在某一定pH值时，使某特定蛋白质分子上所带正负电荷相等，成为两性离子，在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的pH值即为该蛋白质的等电点 （isoelectric point，pI）。 ★ 等电点 ★ 等离子点： 中性盐（Ca2+、Mg2+、Cl-、HPO42+）影响滴定曲线形状 和等电点。 盐离子浓度为0时的等电点称等离子点 ★ 等电点测定 溶解度法 聚焦电泳法 三 蛋白质胶体性质 蛋白质分子直径在1-100nm之间，在水溶液中具有胶体溶液的 性质（布朗运动，丁达耳现象，不能通过半透膜）。 ?? 稳定蛋白质胶体溶液的主要因素 ① 蛋白质表面极性基团形成的水化膜 ② 非等电状态时，同