第十三章动物细胞融合精选.pptVIP

第13章 动物细胞融合 一、动物细胞融合 （一）、概念 动物细胞融合也称细胞杂交，是指在自然条件下或用生物、化学、物理等人工方法，使两个或多个细胞相互接触，从而发生膜融合、质融合和核融合，并形成杂种的过程。 1984年单克隆抗体技术的创始人剑桥大学阿根廷学者Cesar Milstein和英国学者Geoger Kohler获得了诺贝尔医学及生理学奖。 （二）、动物细胞融合的应用及意义 打破生殖隔离 创造新物种？ 生产单克隆抗体 二、抗体 （一）、概述 抗体是在对抗原刺激的免疫应答中，B淋巴细胞产生的一类糖蛋白。它是能与相应抗原特异的结合、产生各种免疫效应（生理效应）的球蛋白 。 国际卫生组织将具有抗体活性及化学结构与抗体相似的一类蛋白统一命名为免疫球蛋白，它与抗体都是指同一类蛋白质。 由两条重链和两条轻链组成“Y”型蛋白分子。 IgG、IgM、IgA、IgE和IgD 五种免疫球蛋白 （二）、单克隆抗体与多克隆抗体 1、定义 多克隆抗体：同一抗原上的多个抗原决定簇同时刺激机体产生的针对不同抗原决定簇的抗体混合物（即在免疫反应中，混合物中的抗体均能与同一抗原起反应，只是针对的抗原决定簇不一样,该抗体是多个B淋巴细胞分泌的） 单克隆抗体 monoclonal antibody ,McAb 单纯针对某一抗原上的某一抗原决定簇的抗体，通常由合成该专一性抗体的单克隆B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合后的杂交细胞 杂种瘤 大量产生，分离纯化而得 单克隆抗体与多克隆抗体 单克隆抗体特点： 高度特异性 高度稳定性 高抗体活性 生物活性单一 单克隆抗体与‘抗癌药物’或‘毒素’结合在一起 就是所谓的 ‘生物导弹’ 第一代单克隆抗体 经杂交瘤细胞生产 第二代单克隆抗体 经过基因重组的嵌合或人源化单克隆抗体 单克隆抗体的局限性 单克隆抗体固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围。 单克隆抗体的反应强度不如多克隆抗体 制备技术复杂，而且费时费工，所以单克隆抗体的价格也较高 单克隆抗体制备原理 单克隆抗体（McAb）是近年来增长率最大的一蛋白类药物，2001年全球销售额接近30亿美元。在这类产品中开发主要集中在癌症治疗药物方面。 2010年全球治疗用单抗药物的销售总额达到440亿美元，100亿美元的单抗诊断和研究试剂， 2011年单抗药物的市场总量已经达到628亿美元。 到2015年，全球单克隆抗体药销售额有望达980亿美元左右。 目前我国单抗市场规模每年以50%以上的速度递增。（来自百度） 三、单克隆抗体的制备 1、抗原与动物免疫 （1）动物选择 生产抗体的免疫动物也采用BALB/C型小鼠。 （2）、抗原 可溶性抗原：蛋白质、核酸、 多肽、多糖等 抗原类型 颗粒性抗原：病毒、细菌、 真菌、细胞等 （3）、免疫途径 腹腔注射：适合于颗粒性抗原 三种方式 皮下淋巴样器官注射 静脉注射：为了取得更好的免疫 效果时使用 2、B淋巴细胞的分离 最后一次免疫后3～5天即可取脾脏分离细胞 （二）、骨髓瘤细胞的制备 骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合过程中，会有 五种不同类型细胞产生 1、骨髓瘤细胞的选择 骨髓瘤细胞来源于BALB/C小鼠， 选择亲本骨髓瘤细胞自身不能分泌任何抗体，且HGPRTˉ或TKˉ。 HGPRTˉ指次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷株 TKˉ指胸腺嘧啶核苷酸激酶缺陷株 常用的骨髓瘤细胞系 2、原因 HGPRTˉ或TKˉ骨髓瘤细胞对HAT选择性培养基敏感。 HAT培养液配方 3、原理 根据DNA的主要合成途径阻断，利用补救途径合成DNA 。 主要途径：氨基酸与一些小分子物 DNA合成 质合成核苷酸，叶酸是重要的辅酶 途径 补救途径：利用次黄嘌呤和胸腺嘧 啶脱氧核苷酸为前体 氨基蝶呤抑制二氢叶酸还原酶活性，阻断DNA的主要合成途径。 此时HGPRTˉ或TKˉ骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合，在HAT培养基上培养，将会产生以下情况： （三）、两亲本细胞融合 先用Hank’s液或无血清培养基洗涤两亲本细胞，以1～2：10（瘤细胞：B淋巴细胞） 2500r/min 弃上清 轻敲 细胞悬液 加入1ml温育的50％PEG （1～2min） 加入无血清培养基15ml 洗涤2次，加入20%的血清培养基 细胞培养37℃，5%CO2培养 添加HAT培养基 换液（去1/3～1/2，加1/3～1/2） 7天后 HT培养基 14天后 普通培养基 融合细胞 融合细胞经HAT培养基筛选后，并非所有杂交瘤细胞都分泌特异性抗体，产生抗体的细胞只占脾细胞的5％，因此要筛选阳性克隆细胞。 增加融合产生抗体的几率，常采用下方法： （1）将淋巴细胞培养于事先包被好抗原的培养板上，轻轻洗涤细胞，剩下的细胞用于融合 （2）在选好的骨髓