流式细胞仪(2014年)资料.pptVIP

流 式 细 胞 仪 流式细胞仪（flow cytometer，FCM）是以激光为光源、检测生物学颗粒理化性质的仪器。 生物学颗粒包括大的免疫复合物、DNA、 RNA、染色体、蛋白质、脂质体、细胞器、病毒颗粒、细菌、真菌、真核细胞、杂交细胞、聚集细胞等。 理化性质包括细胞大小、细胞形状、细胞膜完整性、胞浆颗粒化程度、DNA含量、总蛋白含量、酶活性等。 流 式 细 胞 仪--流式细胞术 流式细胞术（flow cytometry，FCM） 流式细胞术是应用流式细胞仪对悬浮液中的细胞或细胞器进行快速测量和多参数检测的细胞分析技术。同时依赖测量到的参数还可以用物理的方法将一个群体中的细胞亚群分选出来，即流式细胞分选术（cell sorting）。 流式细胞术综合应用了激光技术、流体力学、细胞生物化学技术、荧光标记技术、单克隆抗体技术、分子生物学技术、计算机技术及临床医学等多门技术。 流 式 细 胞 仪--发展历史 流式细胞仪的发展历史 1934年，Moldavan使悬浮的红细胞从一个毛细玻璃管中流过，每个通过的细胞可被一个光电装置记录下来。这就是流式细胞仪的雏形。 1965年，Kamentsky用紫外吸收和可见光散射两个参数同时测量未染色细胞，给出细胞中核酸的含量和细胞大小。奠定了多参数流式细胞测量的基础。 流 式 细 胞 仪--发展历史 1967年，Van Dilla和Los Alamos采用了层流流动室和氩激光器，开发出了液流束、照明光轴、检测系统三者相互垂直的流式细胞仪。这成为目前各种流式细胞仪的基础。 1969年，Fulwyler利用静电墨水喷射液滴偏转技术，建立了流式细胞分选术。 Ehrlich和Wheeless利用飞点扫描技术和缝扫描技术使零分辨率的流式细胞仪变成了低分辨率的流式细胞仪。 流 式 细 胞 仪--发展历史 20世纪70年代，随着Kohler和Milstein成功提出了单克隆抗体技术和荧光标记技术，为特异研究和分析细胞奠定了良好的基础。 1973年，美国BD公司和美国斯坦福大学合作，研制开发并生产了世界上第一台商用流式细胞仪FACS I。 流 式 细 胞 仪--发展历史 20世纪80年代，流式细胞仪的数据采集、存储、显示、分析日趋完善，随着样品制备方法的增加，新的荧光染料和细胞标记物的出现，使流式细胞仪的应用范围逐渐扩大。 20世纪90年代，与之配套的标本制备仪和自动进样器的问世，以及适合临床应用的单克隆抗体的增加，使流式细胞仪逐渐从科研单位进入医院的中心实验室和检验科，成为现代化的临床检验仪器的一部分。 流 式 细 胞 仪--发展历史 目前，流式细胞仪同时朝着更加专业化和更加普及化的两个不同的方向发展。 更加专业化是指仪器更精密、更灵敏地进行更多参数的分析和更快、更纯地进行细胞分选。 更加普及化是指仪器更易于使用，使之成为实验室里更常用的仪器。 流式细胞仪--特点 FCM与其他细胞分析技术相比，有如下特点： 高速度：每秒可检测1 000~5 000个细胞。 高灵敏度：每个细胞只要带有1 000~3 000个荧光分子就能检出，两个细胞之间有5%的差别就可区分出来，光散射的灵敏度为0.3um。 高精度：在细胞悬液中测量细胞，比其他分析技术的变异系数更小，分辨率高。 高纯度：分选细胞的纯度可大于99%以上。 多参数：可同时定量检测单个细胞的DNA等多个参数。 在适当的条件，可对活细胞进行无害性分析和分选。 流式细胞仪--分类 流式细胞仪的分类 根据功能不同，可分为临床型和综合型（科研型）。 根据有无细胞分选功能，可分为流式细胞分析分选仪和流式细胞分析仪。 根据结构不同，可分为一般流式细胞仪（零分辨率流式细胞仪）和狭缝扫描流式细胞仪（高分辨率流式细胞仪）。前者的激光光斑为椭圆形，光斑直径大于被检细胞体积。后者激光光束为一条线状扁平光斑，直径在3~5um。 流 式 细 胞 仪--学习内容 流式细胞仪的基本原理 流式细胞仪的基本结构 流式细胞仪的性能指标 流式细胞仪的使用 流式细胞仪的应用 流式细胞仪实例 I 流式细胞仪的基本原理 基本原理： 将悬浮分散的单细胞悬液，经特异性荧光染料染色 后，放入样品管。 在气体压力的作用下，悬浮在样品管中的单细胞悬液形成样品流垂直进入流式细胞仪的流动室，流动室充满鞘液，在鞘液的约束下，细胞排列成单列由流动室的喷嘴喷出，成为细胞液柱， 液柱与水平方向的入射激光束垂直相交，相交点称为测量区。通过测量区的细胞受激光照射后发出荧光，同时产生光散射。这些信号分别被成90℃角方向放置的光电倍增荧光检测器和前向角放置的光电二极管检测器接收，经过转换器转换为电子信号。 电子信号经模/数转换输入计算机。计算机通过相应的软件储存、计算、分析，就可以得到细胞的大小和活性、