分离方法全套课稿.ppt

当mi、mS以摩尔为单位时，所得相对校正因子称为相对摩尔校正因子（f ’M）,用表示；当mi、mS用质量单位时, 以（f ’W）,表示。 3. 常用的几种定量方法 特点及要求： 归一化法简便、准确。 进样量的准确性和操作条件的变动对测定结果影响不大， 仅适用于试样中所有组分全出峰的情况。 归一化法： 外标法： 外标法也称为标准曲线法。 特点及要求： 外标法不使用校正因子，准确性较高， 操作条件变化对结果准确性影响较大。 对进样量的准确性控制要求较高，适用于大批量试样的快速分析。 1.反相色谱法特点 固定相是利用硅胶表面的游离羟基与各种有机硅烷反应，生成Si-O-Si-C键。 化学键牢固、耐各种溶剂、耐热、柱效高、样品容量大。 能灵活选择流动相，既可分离非离子型化合物，又可分离能离解的或离子型化合物。 色谱系统简单，分析快速，重现性好，柱平衡时间短，柱寿命较长。 反相色谱法的不足： 以硅胶为基质的柱填料能使用的pH值范围局限在2～7.5。 在硅胶表面往往留有一定量未反应的硅醇基，这些活性作用点会吸附溶质，使峰拖尾。 保留机制比其他色谱复杂，需要进一步探讨。 反相色谱的分离模型 当一个非极性溶质或溶质分子中非极性部分与极性溶剂接触时，相互产生斥力，自由能增加。溶质分子中非极性部分的取向导致极性溶剂中形成一个空腔，这种效应称为“疏水”或“疏溶剂效应”。 溶质保留主要不是由于溶质与键合配体之间非极性相互作用，而是由于溶质受极性溶剂的排斥力，促使溶质与键合相烃基发生疏溶剂化缔合。 2.保留机理 （1）疏溶剂理论 solvophobic theory 图3.13 溶质与键合非极性配体的疏溶剂缔合示意图 箭头表示各种作用力 溶质 S 与键合相非极性配位基 L 之间的疏溶剂缔合是可逆的： S+L ? SL 缔合作用强度和溶质的色谱保留取决于三方面因素： 溶质分子中非极性部分的总表面积。 键合相上烃基的总表面积。 流动相的表面张力等性质。 （2）双保留机理 疏溶剂理论假设非极性固定相表面是均匀的有机层，溶质保留是由于溶剂效应，它能有效地解释高含水量流动相反相色谱的保留机理。但键合烃基表面不可能是均匀，有残余硅羟基。微酸性的硅羟基与阳离子或氢键基团相互作用，产生“亲硅醇基效应” siianophilic interaction 或“二次相互作用”。 因而，溶质保留除疏水作用外还存在亲硅醇基作用，“双保留机理”决定溶质的保留值。 例：以乙腈－水缓冲液作流动相分离肽。 曲线1：乙腈／缓冲液。当乙腈含量较高时，肽的保留值升高是由于肽链末端游离－NH2基与硅醇基作用；当水含量升高时，k值升高则是由于疏水效应。 图3.15 反相色谱双保留机理 柱：Supelcosil LC-8 150×4.6mm 流动相：乙腈/5mmol磷酸缓冲液，pH 2.5 试样：H2N-Val-Met-Ala-Gly-Val-Ile-Gly-0Et 曲线2：乙腈／缓冲液＋十二烷基磺酸钠。流动相加入十二烷基磺酸钠，与肽链中氨基形成离子对，消除溶质的极性氨基作用。不再显示硅醇基效应。 曲线3：乙腈／缓冲液+正丁胺。在流动相中加入正丁胺，能消除硅醇基效应，仅存在疏水效应。 3.影响溶质保留的因素 影响反相色谱保留值的主要因素： 流动相的性质和组成。 固定相的性质和表面覆盖率。 改变流动相的组成和性质是控制反相色谱保留值、提高分离选择性、色谱柱效的主要手段。 使用键合固定相应注意的问题 1.硅胶键合相的稳定性 键合相的使用寿命取决于键合的有机官能团在硅胶表面的覆盖程度。覆盖量大增加其稳定性。 正相键合相的稳定性低于反相键合相。 反相烷基键合相的稳定性与使用流动相的pH值相关，水溶液的pH保持在2～7.5，PH＞8.5 引起基体硅胶的溶解。 2.键合相色谱分离的重现性 同一种类型的键合相生产厂家不同、生产批号不同,表现出不同的色谱分离特性。 3.键合相色谱柱的再生 使用键合相色谱柱时，由于大量极性或非极性样品的连续注入，会引起固定相对样品的吸附、缔合等不良效应，而使柱分离性能变差，引起峰形加宽或拖尾等现象，此时应及时对色谱柱进行再生处理。 强极性电离型化合物在反相色谱体系中保留值很低，接近死时间洗出。20世纪70年代初，Schill和Eksborg等提出离子对色谱。分正相和反相离子对色谱，反相离子对色谱应用最广泛。 1.原理： 在色谱体系中加入一种与样品离子电荷相反的离子对试剂。由于形成离子对，使离子型溶质的保留行为和分离选择性发生变化。阴离子、阳离子和两性分子都能和适当的离子对试剂相互作用形成离子对。 离子对色谱的分离模型 三、反相离子对色谱 反相离子对色谱广泛用于羧酸、磺酸、胺、季铵盐、氨基酸、多肽、核酸及其衍生物、