030细胞生物学方法探究.ppt

本章内容提要 细胞形态结构观察方法－－显微技术 细胞组分分析方法 细胞培养与细胞工程技术 细胞生物学研究模式生物 —、光学显微镜 普通生物显微镜由3部分构成 ①照明系统 ②光学放大系统 ③机械装置 显微显微镜物象是否清楚不仅决定于放大倍数，还与显微镜的分辨力（resolution）有关。 分辨力是指显微镜或人的眼睛（25cm处）能分辨物体最小间隔的能力。以分辨率参数表示。 实际应用 介质折射率 细胞中有些物质，如叶绿素，受紫外线照射后可发出荧光；一些物质用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜可对这类物质进行观察。 光源为短波光（紫外光），分辨力高于普通显微镜。 用途 对荧光物质进行定性和定量研究。 相差显微镜的基本原理是，把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。 用途 可观察未染色标本 二、电子显微镜 1 透射电子显微镜 透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）分辨力可达0.2nm，放大倍数可高达近百万倍。 亦称冰冻断裂（freeze-fracture） 扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM），用来观察标本的表面结构。 为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属微粒，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。 扫描电镜分辨力为6~10nm，人眼能够区别荧光屏上两个相距0.2mm的光点，扫描电镜的有效放大倍率为20000X。 可直接观察生物大分子，如DNA、RNA和蛋白质等分子的原子布阵，和生物膜、细胞壁等生物结构的原子排列。 第二节 细胞组分分析方法 一 细胞组分分离技术 目前超速离心机的最高转速可达100000r/min，离心力超过500Kg。 速度沉降（velocity sedimentation） 速度沉降主要用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。 介质密度梯度平缓，分离物按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离。 介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。 适用于分离密度不等的颗粒。 细胞或细胞器在连续梯度的介质中经足够大离心力和足够长时间则沉降或漂浮到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的细胞或细胞器分离。 介质密度较高，陡度大，介质的最高密度应大于被分离组分的最大密度 所需要的力场通常比速率沉降法大10~100倍，往往需要高速或超速离心。 对某些细胞成分进行定性和定位研究，可依据化学反应原理，采用组织化学和细胞化学染色方法（histochemical and cytochemical staining method）加以显示。 2 分子杂交 具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在适当条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA杂交的双链分子。这种技术可用来测定单链分子核苷酸序列间是否具有互补关系。 A 原位杂交（in situ hybridization）：使用标记探针进入组织或组织切片细胞内，检定细胞内特定DNA或RNA序列的存在或位置。 B 印迹杂交（blotting hybridization ）：是体外分析特异DNA序列的方法，DNA或RNA经凝胶电泳分离后，转移到醋酸纤维薄膜上，再用探针杂交，检定互补的特殊核苷序列。 用途 用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。 原理 将放射性同位素标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，将标本制成切片或涂片，涂上卤化银乳胶，经放射性曝光，组织中的放射性即可使乳胶感光。 元素 一般选用14C和3H标记。14C半衰期为5730年，3H为12.5年。常用3H-TDR来显示DNA，用3H-UDR显示RNA；用3H氨基酸研究蛋白质，研究多糖则用3H甘露糖、3H岩藻糖等。 用于将微量的目标DNA大量扩增，以便进行分析。 第三节 细胞培养与细胞工程技术 高等动植物细胞细胞离体后，要求的生存条件极其严格，稍有不适就要死亡。所以细胞培养技术（cell culture）就是选用最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术。 动物细胞的生存环境与植物细胞差别很大，二者的培养方法很不相同。 将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合(confluence)后形成均匀的单细胞层. 原代培养 （primar