染料木素对人胃癌MGC―803细胞增殖及PKA活性的影响.docVIP

染料木素对人胃癌MGC―803细胞增殖及PKA活性的影响 　　[摘要] 目的 本文通过研究染料木素（Gen）对体外培养MGC-803细胞增殖以及PKA活性的影响，探讨Gen抑制MGC-803细胞系增殖的分子机制。方法 光镜下观察经Gen处理后人胃癌MGC-803细胞形态学改变；应用MTT法检测Gen对体外培养的人胃癌MGC-803细胞增殖影响；PepTag法检测Gen对MGC-803细胞PKA活性的调节。结果 与空白对照组比较，经Gen处理后MGC-803细胞外形呈不规则状、细胞间隙增大、折光性差；MTT实验发现Gen能够抑制体外培养的MGC-803细胞增殖，并且抑制作用呈现时间及浓度依赖性；浓度为40 μg/mL的 Gen可以显著上调MGC-803细胞的PKA活性（P0.01）。结论 Gen对人胃癌细胞系MGC-803细胞的增殖有抑制作用，上调PKA活性可能是Gen抑制人胃癌MGC-803细胞增殖的机制之一。 　　[关键词] 染料木素；MGC-803细胞；PKA活性 　　[中图分类号] R735.2 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2014）28-0001-03 　　染料木素（Genistein，Gen）是一种来源于大豆或其他豆科植物的大豆异黄酮，其具有类雌激素、抗氧化、调节血脂等生物活性。流行病学研究和实验研究证实Gen能降低乳腺癌[1]、前列腺癌[2]等激素依赖型肿瘤的发生率，对激素依赖型肿瘤的预防和治疗有一定的疗效。此外，Gen对消化道肿瘤也有明显的抑制作用，然而其抗肿瘤作用机制尚不清楚[3]。本文通过研究Gen对人胃癌细胞MGC-803增殖及PKA活性的影响，探讨Gen抑制MGC-803细胞系增殖的分子机制，为Gen在临床上的应用提供理论依据。 　　1 材料与方法 　　1.1细胞系 　　人胃黏液性腺癌细胞株MGC-803由齐齐哈尔医学院中心实验室赠予。培养基选用RPMI-1640完全培养液，加10%灭活hyclon胎牛血清、100 IU/mL链霉素和100 IU/mL青霉素。收集MGC-803细胞，稀释至1×105/mL，接种于培养皿，37℃、5% CO2及饱和湿度条件下培养。当MGC-803细胞生长覆盖了80%培养皿表面积时要传代，实验时取生长状态良好的对数生长期细胞。 　　1.2 药物与试剂 　　RPMI-1640培养基为Invitrogen产品；胎牛血清为Hyclon产品；Aprotinine、PMSF、DTT、EGTA为Sigma-Aldrich产品；PKA活性检测试剂盒为Promega产品。Gen为陕西天行健生物化学技术有限公司产品，用1 mL MSO溶解配成浓度为40 mg/mL原液，4℃冰箱保存。实验时用培养液将Gen溶液稀释到所需要的浓度。 　　1.3主要实验仪器 　　Milli-Q超纯水系统为MILLIPORE产品；CO2培养箱为NuAire生产；电泳槽为BIO-RAD；CKX31型倒置显微镜为日本Olympus；IF-90紫外透射仪为上海顾林电光仪器厂生产。 　　1.4 实验方法 　　1.4.1 Gen对MGC-803细胞增殖的影响 实验设空白组（完全培养基）、空白对照组和Gen处理组。将对数生长期MGC-803细胞收集、离心并去除上清液，稀释MGC-803细胞至5×104个/mL。按每孔200 μL将MGC-803细胞接种于3块96孔培养板，37℃、5% CO2及饱和湿度条件下培养24 h。然后弃除培养液，Gen处理组分别加入用RPMI-1640培养液稀释的不同浓度Gen溶液200 μL/孔（Gen浓度分别为2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL）， 空白对照组则加RPMI-1640培养液200 μL/孔，空白对照组和Gen处理组均设3个平行孔。在37℃、5% CO2及饱和湿度条件下分别培养24 h、48 h和72 h，各组均在实验终止前4 h时加5 mg/mL浓度的MTT 20 μL/孔，并于4 h后弃除上清液，每孔再加DMSO 150 μL。以空白组（完全培养基）将酶标仪调零，570 nm波长下测定OD值，计算Gen对GMC-803细胞增殖的抑制率。细胞增殖抑制率=（1-Gen处理组平均OD值/空白对照组平均OD值）×100%，实验结果重复3次。 　　1.4.2 Gen对MGC-803细胞形态学影响 实验设空白对照组和Gen处理组。上述两组均培养24 h后移除培养液，空白对照组加200 μL/孔的RPMI-1640培养液，Gen处理组每孔加40 μg/mL Gen溶液200 μL，各组均设平行孔3个。37℃、5% CO2及饱和湿度条件下培养24 h后，光镜下观察经Gen处理后MGC-8