动物病毒灭活验证报告.docVIP

------- 病毒灭活验证报告 文件编号： 编 制： 审 核： 批 准： 日 期： 目 录 目的：确认病毒灭活参数的有效性。 范围：------原料。 验证依据：《血液制品去除／灭活病毒技术方法及验证指导原则》 《血液制品去除／灭活病毒技术方法及验证指导原则》nm） 猪细小病毒 B19 DNA 无 20 伪狂犬病毒 HBV DNA 有 45 附表2 猪源性病毒的理化性质 病毒名称 温度耐受性 化学物质敏感性 猪细小病毒 可耐70℃ 能抵抗脂溶剂酸、甲醛蒸汽和紫外线漂白粉或氢氧化钠具有良好的血凝活性在37下的半衰期为7h，8可存活46天，而在25干草、树枝、食物上可存活10～30天病毒在pH4～9之间保持稳定。5％石炭酸经2min灭活，但0.5％石炭酸处理32天后仍具有感染性。对乙醚、氯仿等脂溶剂以及福尔马林和紫外线照射敏感。血凝抑制新鲜脏器 间接免疫荧光技术中和试验患病动物的病料如脑或扁桃体的压片或冰冻切片直接免疫荧光《猪细小病毒病及其防制》—畜禽流行病防治丛书 金盾出版社冼琼珍;黄良宗;彭启明;王淑敏;顾万军;;猪伪狂犬病毒和猪细小病毒二联PCR诊断方法的建立[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集（上）[C];2003年周泰冲;;猪伪狂犬病毒对人的感染性问题(综述)[J];兽医药品通讯;1986年03期60C o - γ 射线辐照灭活病毒工艺 　 取定量的液态胶原蛋白 , 按 9: 1 的比例分别加入 P R V 、 V S V 、P V 1 和 P P V 指示病毒 , 混匀后先取出部分样品作为液体对照 , 并测定起始病毒滴度 。 剩余样品分装成5 m l / 瓶进行冷冻干燥 , 取出 2 瓶冻干品作为对照 。将冷冻干燥的瓶装胶原蛋白经 10-15 k G y 剂量 的电子束射线辐照灭活病毒处理 ( 绍兴华能电子加速器有限公司) 。 辐照后的样品溶解后测病毒残留滴度 , 对照样品则根据细胞毒性测定结果选择样品稀释度作为病毒灭活的起始病毒滴度 , 计算病毒灭活对数值 。 4.3.4　 存活病毒滴度测定 　 采用微量细胞病变法 。试验样品经 1 0倍系列稀释后加入已接种细胞的 96孔培养板中 , 每个稀释度做 8 孔重复 。将培养板置37℃ 二氧化碳孵箱内培养 72 h ( 接种 P P V 的 P K-15 培 养 1 20 h ) , 在 光 镜 下 观 察 细 胞 病 变 效 应( C P E ) , 根据 K a r b e r 氏法计算病毒滴度。 4.3.5 免疫荧光染色法检测 P P V 　 将 P P V 接种于P K- 15 细胞中 , 培养 120 h 后 , 用抗 P P V 荧光抗体对细胞进行直接免疫荧光抗体试验, 按照抗体说明书要求进行操作 。 4.3.6 　 细胞盲传 　 病毒灭活后的样品均以高浓度加入细胞中做细胞盲传 3 代培养 , 观察是否出现细胞病变 。 在细胞盲传 3 代的全过程中 , 任何时段出现细胞病变均视为阳性 ( + ) , 说明病毒未被完全灭活 ; 未出现细胞病变视为阴性 ( - ) , 说明样品中病毒已被完全灭活 。 4、4 效果的判定??? 判断病毒去除/灭活的有效性须综合考虑，不能仅以病毒去除/灭活的量来确定。在确定有效之前，必须考虑如下因素，审慎评价每次验证结果。1．验证试验所选择的病毒是否适宜，病毒验证的设计是否合理。2．病毒降低量（log10）≥4 logs，表示该步骤去除/灭活病毒有效。如因检测方法造成病毒降低量＜4 logs时，应盲传三代，如无病毒检出，可认定是有效的灭活病毒方法。 ?3．病毒灭活动力学可更好的显示病毒灭活的效果。病毒灭活通常不是简单的一级反应。往往是起始反应速率快，其后变慢。如果病毒灭活速率随时间明显降低，表示该方法可能无效，或者残留的指示病毒对该灭活方法有抵抗力，说明该步病毒灭活方法无效。 ?4．病毒实际滴度为基础病毒，指示病毒与样品1:9的比例混匀后零点取样的病毒滴度，通过与经去除/灭活病毒后的测定的实际病毒残留量的比较，作为该病毒去除/灭活方法（步骤）实际的灭活病毒的量。《血液制品去除／灭活病毒技术方法及验证指导原则》6 0C o - γ 射线灭活效果经照射剂量为 12.3 k G y 的60C o - γ 射线