HXY-生物制药实验.docVIP

实验一 碱裂解法小量制备质粒DNA（4学时） 一、实验目的 1. 了解质粒的特性及其在分子生物学研究中的广泛应用 2. 学习和掌握碱裂解法提取质粒的原理和操作方法 二、实验原理 质粒（plasmid）是细菌细胞内的一种共价闭合环状DNA（简称cccDNA）分子，作为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的染色体之外，质粒DNA上携带了部分的基因信息，经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状，能传给子代并在子代细胞中保持一定的拷贝数，也可丢失及在细菌之间转移。现在常用的质粒大多数是经过改造或人工构建的，常含抗生素抗性基因，是重组DNA技术中重要的载体，可通过连接外源基因构成重组体。 从宿主菌中提取质粒DNA是DNA重组技术中最基础的实验技能。质粒抽提的方法很多，但原理和操作步骤都大同小异，以碱裂解法最为常用。碱裂解法提取质粒是根据质粒的cccDNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。使用SDS和强碱处理裂解细菌细胞后，在pH值介于12.0～12.5这个范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，然而cccDNA的氢键虽会被断裂，但两条互补链彼此相互缠绕，仍会紧密地结合在一起。当加入乙酸钾溶液将pH值恢复至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链迅速而准确地复性，DNA双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中。而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，和不稳定的大分子RNA，变性的蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来，从而可以通过离心去除。 三、试剂和器材 试剂 LB液体培养基 胰蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，NaCl 10g/L，调pH至7.0，高压灭菌。 LB+Amp培养基 LB液体培养基内加入μg/mL的氨苄青霉素。注意Amp遇高温分解，待培养基温度低于60℃时加入。 溶液Ⅰ（50 mM 葡萄糖,25 mM Tris-HCl, 10mM EDTA,pH8.0） 称取0.3g Tris，0.37g EDTA二钠盐，用适量双蒸水溶解后用HCl调pH至8.0，定容到100mL，再加入0.99g葡萄糖。 溶液 Ⅱ（0.2 M NaOH, 1% SDS） 称取0.8g NaOH和1g SDS溶于双蒸水，定容至100mL，现配现用。 溶液 Ⅲ ([K+]=3M, [Acˉ]=5M) 取5 mM KAc溶液60mL，冰醋酸 11.5mL， H2O 28.5mL混匀。 TE缓冲液（10mM pH8.0 Tris-HCl，1mM EDTA） 称取0.12g Tris，0.037g EDTA二钠盐,加适量双蒸水溶解，用HCl调至pH8.0并定容至100mL，高压湿热灭菌，4℃保存备用。 无水乙醇和70%乙醇 酚:氯仿:异戊醇（25:24:1） RNase A（10mg/mL） 称取不含DNA酶的RNase A 0.1g，溶于10mL TE中，沸水加热15min，分装后贮存于-20℃。 材料 携带质粒的大肠杆菌 器材 灭菌锅、恒温摇床、离心机、微量移液器、制冰机、三角瓶、Eppendorf管、试管、培养皿、试剂瓶、超净工作台。 四、实验步骤 (一) 细菌的培养 将含有质粒的大肠杆菌接种于LB+Amp液体培养基中，250 r/min，37℃摇床培养过夜。 (二) 质粒提取 取1.5 mL培养液加入Eppendorf管中，5000 r/min 离心3 min。弃去上清，保留菌体沉淀。如菌量不足可再加入培养液，重复离心，手机菌体。 将菌体沉淀悬浮于100μL溶液Ⅰ中，盖紧管口，充分振荡混匀，室温放置5-10 min。 加入200 μL新鲜配制溶液 Ⅱ，盖紧管口，颠倒数次轻柔混匀 (勿剧烈震荡)，此时菌液应该变得清亮，，将离心管放冰上5 min 。 加入150 μL冰上预冷的溶液 Ⅲ，盖紧管口，温和颠倒数次使混匀，此时出现白色絮状沉淀。冰上放置5-10 min 。 4℃，12000 r/min离心10 min ，将上清转至另一Eppendorf管中。 向上清中加入等体积酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），反复混匀，12000 r/min离心10 min，将上清转移到另一Eppendorf管中。 向上清加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀后，室温放置15-20min。12000 r/min离心10 min。倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干管壁粘附的液体。 加入1mL 70%乙醇洗涤沉淀，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或空气中干燥，即得到质粒DNA制品。 将DNA溶于30 μL TE（含有20 μg/mL的RNase A）中，-20℃保存，备用。 五、注意事项 1.细菌培养过程中要求无菌操作。枪头、离心管等都需要灭菌。 2.制备质