植物衰老生理1.2详解.ppt

植物衰老生理1 植物组织中 可溶性蛋白的测定 衰老时的生理生化变化 蛋白质显著下降,核酸含量的变化,光合速率下降,呼吸速率下降, 生物膜结构变化, 植物内源激素的变化 等。 植物叶片衰老过程中，叶绿素含量下降，叶色变黄，蛋白质含量减少（可溶性蛋白）。 自由基代谢失调, 并在体内积累膜脂过氧化的产物之一：MDA 可溶性蛋白测定的原理 考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合后，溶液的吸收光谱发生变化，从465nm偏转到595nm，并表现出在595nm处的吸收值与溶液中的蛋白质含量有线性关系，其范围从0~1000?g/ml。据此可制作蛋白质的标准曲线，牛血清蛋白为常用的标准蛋白。 待测样品经缓冲液提取后，可溶性蛋白溶于上清液中，蛋白质提取液与考马斯亮蓝G-250反应呈蓝色。测定595nm吸收值，并根据蛋白质的标准曲线，得到样品中可溶性蛋白的含量。 实验步骤 制备蛋白提取液 称叶龄差异明显的叶片各0.50g ，加入5ml 磷酸缓冲液（50mmol，pH值为7.8），于冰浴中研磨提取，匀浆液以8000g 离心力作用下（4?C）离心10min，其上清液即为蛋白提取液。 注意： 2人1组 离心前平衡 蛋白标准曲线的制作 蛋白质标准溶液的配制：称取牛血清蛋白（电泳纯）溶于0.15M NaCl溶液中，制成1mg/ml的母液，再用磷酸缓冲液配成各含0、40、80、120、160μg /200ul牛血清蛋白的标准溶液。 考马斯亮蓝G-250蛋白染色试剂的配制 0~100?g/ml蛋白标准曲线的制作 准确吸取0.2ml各含0、40、80、120、160μg牛血清蛋白的标准溶液，分别放入10ml的试管中，加入4.8ml考马斯亮蓝G-250蛋白染色试剂，混合后放置2min，用10mm厚的比色杯在595nm下比色读取OD值，制作通过原点的直线即为其标准曲线。 显色反应 样品的测定： 取40?l蛋白提取液+160?l磷酸缓冲液于玻璃试管中，加入4.8ml考马斯亮蓝溶液，混匀后放置2min，用10mm厚的比色杯在595nm下比色读取OD值 。对照为空白的磷酸缓冲液加上4.8ml考马斯亮蓝溶液。 可溶性蛋白质含量的计算 可溶性蛋白含量 (μg/g.FW)=标准曲线上查得的蛋白质量（ μg ） × 提取液体积/（测定加样量*鲜重） 植物衰老生理2 植物组织中 丙二醛的测定 MDA测定 MDA在高温、酸性条件下与硫代巴比妥酸(TBA)反应，形成三甲基复合物，该复合物 最大吸收峰在532nm处；最小吸收峰600nm处 消光系数为155 (mM)-1 cm-1 MDA的测定 取上清液1.0ml于7ml离心管中,加TBA与TCA混合液 4.0ml，然后在离心管盖上戳一小孔，92oC水浴保温30min 空白管： 1mL Pi-buffer +TBA与TCA混合液 4.0ml （? 92oC水浴30min）冷却后，平衡，离心5min; 10000rpm 测定A532, A450和A600 MDA含量计算公式 第二次离心的目的何在？ 植物组织中那些物质对丙二醛测定（TBA法）干扰较大？ 研磨、离心时为何可以不用冰浴和低温？ 植物组织中超氧物岐化酶（SOD)活性测定 高等植物叶片中SOD活性随衰老而下降。 测定原理 四氮唑蓝(NBT)光照还原的分光光度法：核黄素受光照产生的O2.-能将NBT还原为蓝色的甲腙，甲腙在560nm波长有最大吸收,而SOD能清除O2.-, 抑制甲腙的产生使吸收减小。通过分光光度检测SOD对O2.-的抑制率,可以表征出SOD含量。 （但是,在水性条件下NBT还原法得到的甲腙是蓝色混悬液,做长时程分析时沉淀表现尤为突出,属分光光度法检测的极端条件,使得该法实验数据重现性差;同时,在560nm波长对此法产生的甲腙进行检测,即使加入过量的SOD,也无法获得100%的对O2.-抑制率.为此,人们在增加甲腙水溶性方面做了许多改良,如添加Met、SDS、BSA助溶以及采用水溶性更好的四唑类替代物等。） 试剂 NBT反应液 含50mM Pi-buffer(pH7.8),13mM甲硫氨酸，63μM NBT,1.3 μM 核黄素和0.1mM EDTA。 步骤 称叶龄差异明显的叶片各1.0g ，加入5ml 磷酸缓冲液（50mmol，pH值为7.8），于冰浴中研磨提取，匀浆液以10000g 离心力作用下（4?C）离心10min，其上清液即为酶提取液。 在暗光条件下加入3mL NBT反应液 和100 μL酶提取液于试管中，在25℃照光（4000-10000lux)并计时,6-25min后出现颜色变化， 9min后测560nmOD值。同时作空白实验。 根据SOD抑制NBT光化学还原的量计算SOD酶活性（un