细菌的革兰氏染色详解.ppt

细菌的革兰氏染色 微生物143015 第六组 革兰氏染色法 革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884年由丹麦医师、细菌学家汉斯·克里斯蒂安·约阿希姆·革兰氏(Hans Christian Joachim Gram,1853-1938)创立。 实验原理：细菌对革兰氏染色的不同反应是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。初染后，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫—碘的复合物，增强染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，革兰氏阳性菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇脱色时细胞壁脱水，使肽聚糖层的网状结构孔经缩小，透性降低，从而使结晶紫—碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂质含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫—碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。 1.革兰氏染色原理是什么 革兰氏阳性菌和阴性菌的细胞壁的组成和结构不同。 第一步；结晶紫使菌体着上紫色。 第二步；碘和结晶紫形成脂溶性大分子复合物，分子大，能被细胞壁阻留在细胞内。 第三步；酒精脱色，细胞壁成分和构造不同，出现不同的反应。 第四步；沙黄或番红复染，增加脱色菌与背景的反差并区别于未脱色菌。 细菌细胞壁的结构 2.革兰氏染色操作可分为哪几步？ 革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是： 1）涂片固定。 2）草酸铵结晶紫染1分钟。 3）自来水冲洗。 4）加碘液覆盖涂面染约1分钟。 5）水洗，用吸水纸吸去水分。 6）加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，20秒后水洗，吸去水分。 7）蕃红染色液（稀）染2分钟后，自来水冲洗 。 8）干燥，镜检。 革兰氏染色的步骤 1）涂片。 注意事项: 1） 载玻片要洁净无油迹 2）滴生理盐水和取菌不宜过多 3）涂片要涂抹均匀，不宜过厚。 2）干燥固定。 自然干燥或者火焰干燥 固定的目的： 1）使细胞质凝固，以固定细胞形态； 2）并使菌体牢固地附着在载玻片上。 固定方法： 涂面朝上，通过火焰数次 注意：温度不宜过高，以玻片背面不烫手为宜， 否则会改变甚至破坏细胞形态 3）染色 （1）初染：加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗 （2）媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖一分钟，水洗 （3）脱色：将水甩净，并衬以白背景，用95%乙醇滴洗至刚刚无紫色为止，约20—30秒，立即用水冲净乙醇 （4）复染：用番红液染1--2分钟，水洗 注意事项: 水洗时，不要直接冲洗涂面，而应使水从载玻片的一端流下，水流不宜过急，以免涂片薄膜脱落。 4：干燥。 自然干燥或用电吹风吹干，也可用吸水纸吸干。 5：镜检。 干燥后，显微镜观察。以分散开的细菌颜色为准，革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。 注意事项: 1.必须等涂片完全干后才可滴加香柏油 2.油镜使用完毕，切记按规定步骤擦干净，否则可能损害镜头 操作步骤 3.媒染的作用是什么，用什么染色剂。 媒染剂的作用增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上使不易脱落。 碘是常用的染色剂。 4.革兰氏染色的关键步骤是那一步，如操作不当，会出现什么现象？ 乙醇脱色是关键 如果脱色过度,有可能会使革兰氏阳性菌呈假阴性 如果脱色不够,有可能使革兰氏阴性菌呈假阳性 5.作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚 1、如果过于浓厚,菌体会很难吸附到载玻片上,染色冲洗过程中很容易别冲下来；。 2、表层被染色,但是内层菌体很难染色.。 3、显微镜观察时很难看清,重重叠叠的细胞,不易观察。 6.水洗吸干的目的是什么？ 水洗冲掉结晶紫多余的浮色，颜色太深厚容易掩盖菌体，影响观察菌体形态。 吸干用滤纸吸干多余水分，以免稀释接下来要做的碘伏，涂片水分过多也影响观察。 * * G＋细菌细胞壁 G-细菌细胞壁 肽聚糖 脂多糖 G+和G-细胞壁的对比 G﹢菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性屏障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。呈紫色。 Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，沙黄复染后呈红色。 无菌操作