实验十二噬菌体效价的测定.docVIP

实验十二 噬菌体效价的测定 实验目的 学习并掌握噬菌体效价的测定原理。 2、学习并掌握双层琼脂平板法测定噬菌体效价。 实验原理 噬菌体属于细菌病毒，它不具备完整的细胞结构，只能通过寄主细胞完成自我复制。因此人类只有通过电子显微镜才可观察到它们的形态结构。但由于噬菌体侵染细菌细胞后，可导致寄主细胞裂解死亡，并在琼脂培养基表面形成是菌斑，所以人们可以此来判断噬菌体的存在。 当烈性噬菌体侵染敏感细菌后,会迅速引起敏感细菌裂解，释放出大量子代噬菌体，然后它们再扩散和侵染周围细胞，结果就会在菌苔上形成一个具有一定形状、大小、边缘和透明度的肉眼可见噬菌斑 plague 。 噬菌体的效价：１mL样品中所含侵染性噬菌体的粒子数。其测定常用双层琼脂平板法。由此得到的噬菌斑形态、大小较一致且清晰度高，计算准确。根据不同稀释度平板上出现的噬菌斑数目，即可算出原液噬菌体的效价。 双层琼脂平板的配制：底层平板（1.5~2％琼脂的LB培养基10ml ，将适当稀释的噬菌体与培养至对数期的受体菌混合，保温吸附，加入45°左右的半固体琼脂糖，迅速混匀铺平板作为上层。 计算公式：噬菌体效价 pfu/ml 噬菌斑数×稀释倍数×10；（这里的10为换算单位，即实验中用到100μl噬菌体原液，换算成1000μl，即1ml时，要乘以10） 操作步骤 流程图 流程 步骤 目的 1、制备9套LB固体培养基底层平板 将融化并冷却至45℃左右的LB培养基倒入无菌培养皿，每皿约10~12ml.水平放置，凝固后做好稀释度标记。 1、提供细菌生长营养物质 2、提供更加平整的平面 2、制备噬菌体稀释液 取0.5mL噬菌体原液于4.5mL无菌水中得到10-1稀释液。再取0.5ml10-1稀释液于4.5ml缓冲液中得到10-2稀释液。同理再制备10-3稀释液，并在试管上标记备用。（稀释过程应充分混匀） 通过连续稀释使单个噬菌体吸附一个大肠杆菌细胞。 3、制备受体菌细胞 将感受态大肠杆菌接种于50ml LB培养液，经过夜培养，离心收集菌体细胞，悬浮于20ml 10mM MgSO4中备用。 由实验员制备。 4、吸附 用取样器分别取100μl 10-1、10-2、10-3噬菌体稀释液和100μl受体菌细胞液，充分混合后置于37℃恒温箱保温25min.并在离心管上做好标记。 —— 5、制备上层平板 用枪分别取350μL受体菌菌悬液和噬菌体稀释液，加入到冷却至45℃左右的0.7%琼脂糖中，迅速混匀，倒在有相应标记的底层平板，边倒边摇匀。 防止琼脂糖凝固结块儿。 6、培养 37℃倒置培养15~18h，检查结果。 —— 结果讨论 噬菌体稀释度 10-2 10-3 1 2 3 1 2 3 噬菌斑数（个）/皿 176 149 177 16 20 17 平均数 67 18 噬菌体效价（10-2） 67×10-2×10 6.7 噬菌体效价（10-3） 18×10-3×10 0.18 思考题 测定噬菌体效价的准确性应注意哪些操作？ 答：噬菌体效价的准确性应注意以下几点： 实验操作为无菌操作，以免杂菌污染； 倒平板的时候要迅速，因为平板易凝，如果倒得太慢会使琼脂糖凝固不均匀； 倒培养基时要稍冷却，以免水汽影响噬菌斑的计数。