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第二十一章 基因诊断与基因治疗 Genetic Diagnosis and Gene Therapy 第 一 节 基 因 诊 断Genetic Diagnosis 二、基因诊断原理和常用技术方法 三、基因诊断的应用 遗传疾病 肿瘤 感染性疾病，传染性流行病 法医学中个体识别、亲子鉴定 第 二 节 基 因 治 疗Gene Therapy * 基因变异致病类型 1.内源基因的变异 基因结构突变 镰刀型红细胞贫血 遗传性疾病 基因表达异常 血友病 遗传性疾病 2.外源基因的入侵 鼻咽癌-EB病毒 恶性肿瘤 特点： 针对性强 特异性强 灵敏度高 适应性强 一、基因诊断的定义和特点 定义： 利用现代分子生物学和分子遗传学的技术和方法，直接检测基因结构 DNA水平 及其表达水平 RNA水平 是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。 基因诊断原理： 检测相关基因的结构或表达是否异常。 结构异常－ DNA的缺失、插入、到位和突变等。 表达异常－ RNA含量异常升高或降低甚至缺如。 斑点杂交 等位基因特异的寡核苷酸探针杂交 单链构象多态性 限制性内切酶谱分析法 DNA限制性长度多态性分析 Northern Blot （一）核酸分子杂交技术 基因诊断常用技术方法 斑点杂交 正常DNA样品 待测DNA样品 硝酸纤维素膜 等位基因特异的寡核苷酸探针杂交 －检测基因点突变的方法 5`ACGGTCGATGCAATCGTACAACCTTGGACGTGGACTGCGGATTTGCCG3` T 3`TTAGCATGTTGGAACCTGC5` 正常探针 3`TTAGCATGTAGGAACCTGC5` 突变探针 正常 突变杂合子 突变纯合子 基因型 染色体 A膜＋正常探针 B膜＋突变探针 单链构象多态性－检测基因点突变的方法 正常 突变杂合子 突变纯合子 电泳 镰刀型红细胞贫血患者基因组 × MstⅡ酶切位点 GCTNAGG 5′ 3′ 正常基因 5′ 3′ 突变基因 1.15kb 1.35kb 限制性内切酶图谱分析 GAG→GTG Glu→Val GCTGAGG→GCTGTGG 0.2kb + ﹣ 0.2kb 1.15kb 1.35kb 正常人 突变杂合子 携带者 突变纯合子 患者 镰刀型红细胞贫血患者基因组的限制性内切酶图谱分析 DNA限制性片段长度多态性分析（RFLP） DNA多态性：人群中DNA上的碱基会发生中性突变， 导致个体间核苷酸序列的差异。 DNA多态性多发生在限制性内切酶位点上。 致病基因→多态性片段→遗传标记 孟德尔遗传定律（分离律和自由组合规律） A A b b c C 同源染色体 A × * ① ② ③ RLFP分析法 Northern Blot－检测某一基因的转录产物mRNA 提取细胞或组织的总RNA 电泳分离 探针杂交 显色或显影 ＋ — 电泳 （二）聚合酶链反应 PCR ①94度变性 ②58度退火 ③72度延伸 循环 RT－PCR：检测某一基因的转录产物mRNA 提取细胞或组织的总RNA 逆转录成总cDNA（complementary DNA PCR RNA RNA DNA - DNA - DNA + DNA - ① ② ③ ④ （三）基因测序 （四）基因芯片（gene chip） 利用核酸杂交的原理，应用于DNA、RNA的研究。 背景资料　　基因芯片是利用点样机等机械装置，在玻璃等支持物表面整齐地点上高密度的、成千上万个“点”，每个“点”含有可与一种基因杂交的一条ＤＮＡ探针。在芯片上滴加样品后，在合适的条件下，样品中含有的各种核酸片段（ｃＤＮＡ）就与相应的探针杂交。由于核酸片段上已标记有荧光素，激发后产生的荧光强度就与样品中所含有的相应核酸片段的量成正比，也就代表该基因的表达量。经激光共聚焦扫描仪等装置扫描后，所获得的信息经专用软件分析处理，即可获得成千上万种基因的表达情况。 微阵列（microarray） 高通量 *