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鼠抗人cTnI单克隆抗体Fab段基因克隆和序列分析 公文易文秘资源网　佚名　2008-10-14 0:33:41　我要投稿　 添加到百度搜藏 提取的RNA纯度很高. H1,H4,H5,H7上游引物与下游引物IgG1扩增出800 bp左右片段；H3扩增出400 bp左右片段；H2,H6未见片段扩出（图1）. 下游引物IgG2b，IgG3与所有上游引物配对均未见片段扩出. 测序报告证实H1，H4，H5，H7引物扩增的重链Fd段基因具有同源性. 图2, 3为轻链PCR扩增电泳图，将扩出的所有片段进行测序，表明L13引物扩增出700 bp左右片段为抗体序列片段，其余为非抗体序列片段. 　　M：DL2000 marker;1～71～7对上游引物扩增的重链PCR产物. 　　图1 重链Fd琼脂糖凝胶电泳（略） 　　M：DL2000 marker;1～51～5对上游引物扩增的重链PCR产物. 　　图2 1～5对上游引物扩增的轻链PCR产物电泳（略） 　　2.2 转化感受态细菌 选取H1和L13的PCR产物作连接反应，转化感受态细胞，可以看到重链和轻链组分布均匀的蓝白菌落，二者比例约为11，白色菌落均有20余个，对重链、轻链分别挑取16个菌落. 　　2．3 菌落PCR电泳 可见重链800 bp左右的片段，可见轻链700 bp左右的片段（图4，5），证明有目的片段插入T载体中. 用小量质粒抽提试剂盒将质粒抽提出来，送至TaKaRa公司测序. 　　2.4 重组质粒的插入片段测序报告［7-9］ GenBank 登录号分别为AY484430，AY484431.轻链第23位和第93位亦为骨架区的两个半胱氨酸（Cys）. 上述获得的抗体Fab段基因即是杂交瘤细胞正常表达的抗人cTnI 单抗基因, 为IgG1亚型. 网上核对V BASE数据库，重链可变区属于VH3家族，J段来源于JH3a，轻链可变区属于VK亚类（Subgroup），J段来源于JK2. 　　M：DL2000 marker；1～86～13对上游引物扩增的轻链PCR产物. 　　图3 6～13对上游引物扩增的轻链PCR产物电泳（略） 　　M：DL2000 marker;1，6，8，9：未插入重链Fd段的PCR产物；2～5，7：插入重链Fd段的PCR产物. 　　图4 重链片段的菌落PCR琼脂糖凝胶电泳（略） 　　M：DL2000 marker;1～4，6～13，15，16：插入轻链片段的PCR产物；5，14：未插入轻链片段的PCR产物. 　　图5 轻链片段的菌落PCR琼脂糖凝胶电泳（略） 　　3 讨论　　由于本实验室已有能分泌mAb cTnI的杂交瘤细胞系，因此，我们首先合成若干对通用引物，用RTPCR技术，将抗cTnI抗体的Fab段基因扩增出来，测序，经Internet网(网址：/igblast)［7］核实，发现H1，H5，H7 3种引物扩增出来的重链序列具有同源性，为同一序列；在轻链基因克隆中，获得一个无功能的轻链产物，它来自杂交瘤亲代细胞之一骨髓瘤细胞SP2/0. 有关该骨髓瘤细胞分泌轻链的全序列已见报道，最突出的特点是其轻链基因的第23位氨基酸是酪氨酸（Tyr），而不是真正杂交瘤细胞所分泌轻链的半胱氨酸（Cys）. 如L25，L610等上游引物扩增出来的cDNA片段，均为这种无功能的轻链产物. L1，L11, L12等上游引物扩增出来的cDNA片段测序，经核实证明，缺失FR1和CDR1功能区. 唯有L13上游引物扩增出来的700 bp的cDNA片段为有功能的轻链基因产物. 为得到完整的Fab段基因序列，取H1和L13引物PCR产物做TA克隆. 测序结果用BLAST和DNAman软件分析，得到氨基酸序列的编码框，中间都没有中止密码. 目前国内外尚未见抗cTnI抗体基因序列相关报道. 在本实验中所得到的重链和轻链的基因序列已经被美国国立医学图书馆的免疫球蛋白数据库收录，登录号分别为AY484430，AY484431. 抗人cTnI抗体的Fab段基因的克隆及序列分析为抗人cTnI嵌合抗体的真核蛋白表达打下基础. 【参考文献】　　［1］ 张寄南，杨国平，苏恩本, 等.血清肌钙蛋白I诊断急性心肌梗塞的研究［J］，中华心血管病杂志，1997, 25(5), 379-382.　　［2］ 张寄南，苏恩本，魏 瑾, 等.血清肌钙蛋白I升高与病毒性心肌炎诊断及病程关系探讨［J］，中华心血管病杂志，1999, 27(6), 421-424.　　［3］ Nageh T, Sherwood RA, Harris BM, et al. Cardiac troponin I for risk stratification following percutaneous coronary artery int