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实验一、重组木聚糖酶的亲和层析纯化 实验目的 掌握His-tag亲和层析柱纯化蛋白的方法 实验原理 由xynB基因编码的木聚糖酶有很高的热稳定性，在90℃下保温2h，仍然有90%的活性，基于这一点，我们可以先用加热的方法除去酶液中的大部分不耐热的杂蛋白。 蛋白质表面的某些氨基酸残基如：组氨酸的咪唑基团，半胱氨酸的巯基，色氨酸的吲哚基团（后两种与金属离子的作用要小得多），可与金属离子亲和结合。用螯合剂可以将金属离子（Cu2+、Zn2+、Ni2+、Co2+His-tag）：组氨酸是具有杂环的氨基酸，每个组氨基酸含有一个咪唑基团，这个化学结构带有很多额外电子，对于带正电的化学物质有静电引力，亲和层析是利用这个原理来进行吸附的，亲和配体（也就是填料）上的阳离子（一般是镍离子）带正电对组氨酸有亲和作用。组氨酸标签是原核表达载体上6个组氨酸的区段Ni-NTA亲和层析介质X Charge buffer：50 mmol/L NiSO4 1X Binding buffer：5mmol/L 咪唑，0.5 mol/L NaCl, 20mmol/L Tris-HCl，最终pH调到7.9 1X Wash buffer：60mmol/L咪唑，0.5 mol/L NaCl, 20 mmol/L Tris-HCl ，最终pH调到7.9 1X Elute buffer：1 mol/L咪唑，0.5 mol/L NaCl, 20 mmol/L Tris-HCl ，最终pH调到7.9 1X Strip buffer：100 mmol/L EDTA，0.5mol/L NaCl, 20 mmol/L Tris-HCl ，最终pH调到7.9 以上各成分的浓度为终浓度。 B.实验设备 移液管、试管、分光光度计、pH计、控温水浴锅、煮沸电炉、煮沸用的浮漂、铁架台 4、实验步骤 样品上样前，取出少量样品作为后面的SDS实验用。所有的试剂均需用0.45μm的微孔滤膜过滤后使用。 ①his-tag亲和柱处理 1. 取1mL Ni-NTA亲和层析介质1X Charge buffer洗柱子。 4. 再用3柱体积的1X Binding buffer洗柱子。 5. 把加有1X Binding buffer的粗酶液样品加入柱子。 6. 用10柱体积的1X Binding buffer洗柱子。 7. 接着用6柱体积的1X Wash buffer洗柱子。 8. 然后用6柱体积的1X Elute buffer洗脱柱子，此时注意用干净的EP管分部收集洗脱液。 9. 洗脱完后用4倍柱体积的1X Strip buffer洗柱子。 10. 最后用10倍柱体积的无菌水冲洗柱子，然后用20%的酒精充满柱填料，4℃下保存。 ② 分别测定上述收集的洗脱液木聚糖酶活，得到较高酶活的部分合并，并留出少量样品作为后面的SDS实验用，余下样品在-20℃保存备用。 酶活性，测定方法如下： 对照（空白）：取240μL的0.5%的木聚糖溶液于比色管中，加入10μL0.1 mol/L pH5.8 (90℃) 的缓冲液LDNS试剂沸水浴5min，流水冷却。 样品组：取240μL的0.5%的木聚糖溶液于比色管中，加入稀释酶液10μ（稀释的倍数要保证OD540的读数在0.1～1之间），在90℃水浴锅中反应10min，结束后取出立即加入750μLDNS，沸水浴5min，流水冷却后，用分光光度计在540nm下测定吸光度，用对照调零，根据光密度值从标准曲线上得到还原糖的浓度，并进一步算出各个样品的酶活性（U/mL）。 实验二、蛋白胶的制备 1、实验目的 学会采用SDS(SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳)分析基因工程产物 2、实验原理 SDS电泳是主要用来测定蛋白质分子量大小及纯度分析的技术。如果在PAGE系统中加入十二烷基硫酸钠(SDS)，则蛋白质的迁移率主要取决于其分子量的大小，而与蛋白质所带的电荷和形状无关。SDS是阴离子去污剂，它能与蛋白质的疏水部分结合，并能把大多数的蛋白质分子拆分成亚基形式。由于大多数蛋白质与SDS结合的摩尔比为1.4：1，结合量很大，因此，加人SDS增加了蛋白质表面的负电荷，屏蔽了没有SDS时正常存在的任何一种电荷。SDS与蛋白质结合后，引起了蛋白质构象的变化，使得雪茄形状的蛋白质分子的轴比发生改变。在巯基乙醇的作用下，二硫键还原为巯基，不同蛋白质组成的短轴趋于一致，长轴与分子量成正比。因此，它们的电泳速度不取决于电荷和形状，仅与蛋白质的分子量有关。 目前较流行的SDS使用的都是线性垂直薄板状胶，这种胶是指在两层支持的玻璃板之间形成的薄片状凝胶。由于薄片胶可在同一胶上跑很多样品，使聚合、染色脱色具有一致性，所以薄片胶比管状胶的应用更广泛，本实验是按照Bio-rad的小凝胶系统来设计的，这些步骤也适用于其他系统。