菌种选育与培养.docVIP

第三章 菌种选育与培养 教学目的：1、熟悉工业发酵常用微生物种类；掌握菌种分离、筛选和选育的方法；掌握种子扩大培养方法；掌握常规的菌种保藏方法 6、藻类（algae）：用作人类保健食品和饲料，如螺旋藻、栅列藻；可通过藻类将CO2转变为石油，或获取氢能。 二、微生物工业对菌种的要求 目前，随着微生物工业原料的转换和新产品的不断出现，势必要求开拓更多新品种。尽管微生物工业用的菌种多种多样，但作为大规模生产，对菌种有下列要求： 1、原料廉价、生产迅速、目的产物产量高； 2、易于控制培养条件，酶活性高，发酵周期较短； 3、抗杂菌和噬菌体的能力强； 4、菌种遗传性能稳定，不易变异和退化，不产生任何有害的生物活性物质和毒素，保证安全生产。 三、重要工业微生物的分离 分离是指从含微生物的样品（如土壤、水等）中获得纯的或混合的培养物，是筛选具有潜在工业应用价值的微生物的第一个阶段，接着才能从以上分离物中筛选出那些能产生所需产物或具有某种生化反应的菌种。 1、施加选择压力的分离方法 （1）富集液体培养 富集培养是指能增加混合菌群中所需菌株的数量的一种技术。方法的要领是给混合菌群提供一些有利于所需菌株生长或不利于其他菌株生长的条件。例如，供给特殊的基质或加入某些抑制剂。 （2）固体培养基的使用 该方法常用于分离某些酶产生菌，其选择培养基中常含有该酶的作用底物。 2、随机分离方法 （1）抗生素产生菌的筛选 （2）生长因子产生菌的筛选 生长因子如氨基酸和核苷酸等的生产不能作为分离步骤中的选择压力，可用随机办法分离产生菌，并通过随后的筛选试验检验出产生菌。 （3）多糖产生菌的筛选 可从菌落的粘稠外观识别这类产生菌。 第二节 工业微生物菌种的选育 一、自然选育 定义：在生产过程中，不经过人工诱变处理，根据菌种的自发突变而进行菌种筛选的过程，叫做自然选育或自然分离。 1、从自然界分离获得菌株 一般包括以下几个步骤：采样、增殖培养、纯种分离和性能测定等。 2、从自发突变体中获得菌株 自发突变的频率较低，因此自然选育筛选出来的菌种，不能满足育种工作的需要。因而不能仅停留在“选”种，还要进行“育”种。如通过诱变剂处理菌株，就可以大大提高菌种的突变频率，扩大变异幅度，从中选出具有优良特性的变异菌株-诱变育种。 二、诱变选育 定义：使用诱变剂对菌种进行人工诱变，提高突变频率和扩大变异谱的育种方法。具有速度快、方法简便等优点，是当前菌种选育的一种主要方法，使用普遍。 1、诱变育种的主要环节： （1）出发菌株的选择 工业上用来进行诱变处理的菌株，称为出发菌株（parent strain）。 一般有三种：从自然界分离得到的野生型菌株；通过生产选育，即由自发突变经筛选获得的高产菌株；已经诱变过的菌株。 选择纯种作为出发菌株，借以排除异核体或异质体的影响。 不仅选产量高的，还要考虑其他因素，如产孢子早而多，色素多或少，生长速度快等有利于合成发酵产物的特性。 选择对诱变剂敏感且变异幅度广的菌株作为出发菌株，可以提高变异频率，而且高产突变株的出现率也大。 （2）菌悬液的制备 （3）前培养 （4）诱变 物理诱变剂：各种射线，如紫外线（焦耳）、X射线（库仑/千克）、β射线、γ射线、α射线和超声波等； 化学诱变剂：甲基磺酸乙酯（EMS）、亚硝基胍、亚硝酸、氮芥等。 诱变剂 诱变剂的剂量 处理时间 缓冲剂 中止反应方法 亚硝酸（HNO2） 0.01～0.1mol/L 5～10min pH值4.5，1mol/L醋酸缓冲液 pH8.6，0.07磷酸二氢钠 硫酸二乙酯（DES） 0.5～1％ 10～30min， 孢子18～24h pH值7.0，0.1mol/L磷酸缓冲液 硫代硫酸钠或大量稀释 甲基磺酸乙酯（EMS） 0.05～0.5mol/L 10～60min， 孢子3～6h pH值7.0，0.1mol/L磷酸缓冲液 硫代硫酸钠或大量稀释 亚硝基胍（NTG） 0.1～1.0 mol/mL， 孢子3mg/mL 15～60min， 90～120min pH值7.0，0.1mol/L磷酸缓冲液或Tris缓冲液 大量稀释 亚硝基甲基胍（NMU） 0.1～1.0 mol/mL 15～90min pH值6.0～7.0，0.1mol/L磷酸缓冲剂或Tris缓冲液 大量稀释 氮芥 0.1～1.0 mol/mL 5～10min NaHCO3 甘氨酸或大量稀释 乙烯亚胺 1:1000～1:10000 30～60min ? 硫代硫酸钠或大量稀释 羟胺（NH2OH?HCl） 0.1～0.5％ 数小时或生长过程中诱变 ? 大量稀释 氯化锂（LiCl） 0.3～0.5％ 加入培养基中，在生长过程中诱变 ? 大量稀释 秋水仙碱（C22H25NO6） 0.01～0.2％ 加入培