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下一代测序技术：技术回顾与展望 2010-02-11 09:15:28 来源：易生物实验 浏览次数：4203 网友评论 0 条 DNA?测序技术的数据产出能力呈指数增长,?而且这一技术本身也演变成为一个面向工程学和物理学的新技术领域.?本文分析了下一代测序仪的技术特点,?并对其未来的发展以及应用进行了前瞻性的展望.? 关键词：测序DNA测序DNAsequencing 周晓光*, 任鲁风, 李运涛, 张猛, 俞育德, 于军*① 中国科学院北京基因组研究所, 基因组科学与信息重点实验室, 北京 100029; 中国科学院半导体研究所, 北京 100083* 联系人, E-mail: junyu@big.ac.cn; joezhou@big.ac.cn摘要 在过去的30 年中, 作为最重要的生物医学研究手段之一, DNA 测序技术的数据产出能力呈指数增长, 而且这一技术本身也演变成为一个面向工程学和物理学的新技术领域. 本文分析了下一代测序仪的技术特点, 并对其未来的发展以及应用进行了前瞻性的展望. 预期在刚刚出现的技术中, 有些技术假以时日能够发展成熟, 实现1000 美元基因组和100 美元基因组的目标. 同时建议中国科学家在这场对科学研究以及社会医疗保健体系都将产生深远影响的运动中发挥积极的作用. 关键词：基因组学、DNA 测序、下一代测序技术、测序仪DNA 测序技术自发明以来就一直在推动分子生物学发展方面起着至关重要的作用[ 1 ] . 从早期 Frederick Sanger 的手工测序, 以及基于Sanger 法开发的第1 代自动化测序仪, 到目前的下一代测序平台, 这一领域已经发生了巨大的变化[2]. 有人甚至将基因组测序技术的发展与半导体技术的发展相提并论, 这也不无道理[3]——在过去的数十年中, 每经过几年, 测序速度就呈指数增长, 与半导体工业发展的摩尔定律 Moore’s law 非常相似[4]. 这种高速的发展, 如图1 所示, 从根本上改变了人们研究所有生命蓝图的方式. 并且推动了基因组学及其分支乃至其他密切相关学科的创立与发展, 诸如比较基因组学、生物信息学、系统生物学以及合成生物学. 某种程度上, DNA 测序技术的进展已经使生命研究的基本元素发生了转变——从单一、局部的基因或基因的片段转变成整个基因组. 反过来, 这种转变又需要更加强大的测序技术来支持. 测序技术与其应用之间的协同关系使得两者的发展在可预见的未来内保持这种趋势, 并且由于其对个体化疾病诊断与治疗具有确定性的推动作用而加速. 本文回顾了测序技术的演进, 分析几代测序技术的优点与缺点. 并对这一领域可能的发展方向做出了预测. 为便于讨论, 根据技术的进展, 将测序技术分为具有不同亚代的3 代 表1 . 尽管根据技术进展将其划为不同世代有些武断, 但是这种方法还是能够体现每个阶段的关键技术进展. 图1 测序技术发展时间轴 1 技术回顾与近期发展1.1 第1 代测序技术——荧光标记的Sanger 法在第一台全自动测序仪出现之前, 使用最为广泛的测序方法就是Sanger 在20 世纪70 年代中期发明的末端终止法测序技术. Sanger 也因此获得1980 年的诺贝尔化学奖[5]. 他的发明第一次为科研人员开启了深入研究生命遗传密码的大门. 原来的方法主要依靠手工操作, 难以自动化. 例如, 它利用放射性同位素标记引物来进行DNA 梯状成像, 操作十分不方便. 要使用双脱氧核苷酸分别做 4 个末端终止反应, 然后采用平板凝胶电泳技术, 用 4 条电泳道来分离4 个反应所得产物, 费时费力, 试剂消耗也大, 这些都严重限制了测序的通量. 因此, 对于开发非放射性的第一代测序技术势在必行. 1 G1.1. 最早版本的第1 代测序仪是20 世纪80 年代中期在Cal Tech 的Leroy Hood 实验室发明的[6]. 这一测序仪通过修改Sanger 法得以实现. 最关键的改变是采用具有颜色的荧光染料代替同位素标记. 4 种双脱氧核苷酸终止子被标记上不同颜色的荧光基团. 另外, 与最初的Sanger 法不同, 荧光基团是标记在终止子上, 而不是在引物上. 这种不同颜色标记的方案可以实现一个反应管中同时进行4 个末端终止反应. 采用聚丙烯酰胺凝胶分离, 并通过计算机荧光检测系统分析梯状反应产物. 这些改进极大地提高了测序速度, 减少了测序过程中的人为干扰. 次年, 利用Leroy Hood 实验室的技术, ABI 推出了第一款半自动DNA 测序仪ABI 370[7]. 在随后的 20 年中, 测序仪的性能得到了极大的提升. 但基本工作原理直到最近才有所改变.  2 G1.2. 第1 代测序仪的第2 个版本出现