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波菜色素的提取和色素分离 extrction of pigments from spinach and chromagraphic isolation 一、实验目的 1 、通过绿色植物色素的提取和分离，了解天然物质分离提纯方法； 2 、通过柱色谱和薄层色谱分离操作，加深了解微量有机物色谱分离鉴定的原理。 二、实验原理 绿色植物如菠菜叶中含有叶绿素（绿）、胡萝卜素（橙）和叶黄素（黄）等多种天然色素。 叶绿素存在两种结构相似的形式即叶绿素 a C55 H72O5N4Mg 和叶绿素 b C 55H7O6N4Mg ，其差别仅是 a 中一个甲基被 b 中的甲酰基所取代。它们都是吡咯衍生物与金属镁的络合物，是植物进行光合作用所必需的催化剂。植物中叶绿素 a 的含量通常是 b 的 3 倍。尽管叶绿素分子中含有一些极性基团，但大的烃基结构使它易溶于醚、石油醚等一些非极性的溶剂。 胡萝卜素（ C40H56 ）是具有长链结构的共轭多烯。它有三种异构体，即 a-, β - 和γ - 胡萝卜素，其中β - 异构体含量最多，也最重要。在生物体内，β - 体受酶催化氧化即形成维生素 A 。目前β - 胡萝卜素已可进行工业生产，可作为维生素 A 使用，也可作为食品工业中的色素。 叶黄素（ C40H56O2 ）是胡萝卜素的羟基衍生物，它在绿叶中的含量通常是胡萝卜素的两倍。与胡萝卜素相比，叶黄素较易溶于醇而在石油醚中溶解度较小。 本实验从菠菜中提取上述几各色素，并通过薄层层析和柱层析进行分离 三、主要仪器与试剂 ? 仪器：研钵、布氏漏斗、圆底烧瓶、直形冷凝管、层析缸 试剂：硅胶 G ，中性氧化铝，甲醇，石油醚（ 60-90 ℃），丙酮，乙酸乙酯，菠菜叶。 四、实验流程 五、操作步骤 1 、菠菜色素的提取 称取 2g 洗净后的新鲜的菠菜叶，用剪刀剪碎并与 10mL 甲醇拌匀，在研钵中研磨约 5min 然后用布氏漏斗抽滤菠菜汁，弃去滤渣。 将菠菜汁放回研钵，每次用 10mL 3:2 （体积比）的石油醚 - 甲醇混合液萃取两次，每次需加以研磨并且抽滤。合并深绿色萃取液，转入分液漏斗，每次用 5mL 水洗涤两次，以除去萃取液中的甲醇。洗涤时要轻轻旋荡，以防止产生乳化。弃去水 - 甲醇层，石油醚层用无水硫酸钠干燥后滤入圆底烧瓶，在水浴上蒸去大部分石油醚至体积约为 1mL 为止。 2 、薄层层析 ?取四块显微载玻片，用硅胶 G 加 0.5% 羧甲基纤维素调制后制板，晾干后在 110 ℃活化 1h 。 展开剂：（ a ）石油醚 - 丙酮 8:2 （体积比） （ b ）石油醚 - 乙酸乙酯 6:4 （体积比） 取活化后的层析板，点样后，小心放入预先加入选定展开剂的广口瓶内，盖好瓶盖。待展开剂上升至规定高度时，取出层析板，在空气中晾干，用铅笔做出标记，并进行测量，分别计算出 Rf 值。 分别用展开剂 a 和 b 展开，比较不同展开剂系统的展开效果。观察斑点在板上的位置并排列出胡萝卜素、叶绿素和叶黄素的 Rf 值的大小次序。注意更换展开剂时，须干燥层析瓶 在层析柱中，加 3cm 高的石油醚。另取少量脱脂棉，先在小烧杯用石油醚浸湿，挤压以驱除气泡，然后放在层析柱底部，轻轻压紧，塞住底部。将 3g 层析用的中性氧化铝（ 150－160 目），从玻璃漏斗中缓缓加入，小心打开柱下活塞，保持石油醚高度不变，流下的氧化铝在柱子中堆积。必要时用橡皮锤轻轻在层析柱的周围敲击，使吸附剂装得均匀致密。柱中溶剂面由下端活塞控制，既不能满溢，更不能干涸。装完后，上面再加一片圆形滤纸，打开下端活塞，放出溶剂，直到氧化铝表面溶剂剩下 1－2mm 高时关上活塞（注意！在任何情况下，氧化铝表面不得露出液面）。 将上述菠菜色素的浓缩液，用滴管小心地加到层析柱顶部，加完后，打开下端活塞，让液面下降到柱面以上 1mm 左右，关闭活塞，加数滴石油醚，打开活塞，使液面下降，经几次反复，使色素全部进入柱体。 待色素全部进入柱体后，在柱顶小心加洗脱剂—石油醚 - 丙酮溶液 9:1 （体积比）。打开活塞，让洗脱剂逐滴放出，层析即开始进行，用锥形瓶收集。当第一个有色成分即将滴出时，取另一锥形瓶收集，得橙黄色溶液，它就是胡萝卜素。 用石油醚 - 丙酮 7:3 （体积比）作洗脱剂，分出第二个黄色带，它是叶黄素 （ 1 ） 。再用丁醇 - 乙醇 - 水 3:1:1 （体积比）洗脱叶绿素 a （蓝绿色）和叶绿素 b （黄绿色）。 六、注释 （ 1 ）叶黄素易溶于醇而在石油醚中溶解度较小，从嫩绿菠菜得到的提取液中，叶黄素含量很少，柱色谱中不易分出黄色带。 七、思考题 1 、试比较叶绿素、叶黄素和胡萝卜素三种色素的极性，为什么胡萝卜素在层析柱中移动最快？ * *