柑桔原生质体操作.docVIP

柑桔原生质体操作 ? 1. 胚性悬浮系的建立： 从固体培养基上取继代20天左右生长旺盛的愈伤组织于MT +ME 0.5g /L+ 谷氨酰胺1.5 g/L +蔗糖 40g/L 的液体培养基中 （每瓶50 ml），100转振荡培养，每两周继代一次，3 代后用于分离原生质体。 2.无菌苗的获得：柑桔种子无菌条件下播种于MT培养基上，20-30天后叶片充分展开后用于分离原生质体。 二、原年质体的分离 1. 悬浮系原生质体的分离： 用吸管吸取1g 左右的继代6-10 天的悬浮培养物于15x60 mm的培养皿中，吸干培养基，加入1.5 ml 0.7 EME 和1.5 ml 酶混合液，轻轻摇匀，封口膜封口，置于摇床上（20-30转）或静置，28℃暗条件下酶解16-24小时。 2. 叶肉原生质体的分离：1.5 ml 0.6 EME 加入一15x60 mm的培养皿中，在此培养皿用解剖刀将叶片切成0.05-0.1cm的细条，后加入1.5 ml 酶混合液，轻轻摇匀，封口膜封口，置于摇床上（20-30转）或静置，28℃暗条件下酶解16-24小时。 三、 原生质体的纯化： 1. 酶解后的原年质体经孔径为45 μm 的不锈刚网去掉渣质,CPW13 洗涤以收集大量原生质体,滤液在10ml 离心管中离心（100转）10分钟，使原生质体沉于管底。 2. 沉淀物用3ml CPW25 悬浮，在其上轻轻加入1ml CPW13 ，100转离心2-6 分钟，原生质体在两液面间形成一条带，其它杂质及少量原生质体沉于管底。（注：如果此种情况下无法形成界面，则原生质体沉淀物用CPW13 悬浮） 3. 将原生质体轻轻吸出，置于另一离心管中，用电融合液离心洗涤6-8分钟，去掉上清液，用电融合液悬浮至5-10 x 105 个/ml 备用。（用血球计数板调密度，一个大方格中原生质体数x10000即是原生质体密度） 四、原生质体活性检查 FDA用丙酮配制成5 mg/ml 的浓度。按25 μl FDA /ml 原生质体的比例加入FDA，5 分钟后在万能显微镜下检查原生质体活性（暗视野下发荧光原生质体数/明视野下原生质体总数）。 注：叶肉原生质体发红色荧光，而悬浮原生质体发黄色荧光。 五、原生质体融合 一）???????????? PEG法 1. 将悬浮好的双亲原生质体等体积混合 2. 用吸管滴2 滴混合好的原生质体于15 x 60cm 塑料培养皿中央，立即加入40% 的PEG 2 滴诱导融合 3. 10 分钟后，加入稀释液（9A/1B）2 滴 4. 15 分钟后，从边缘缓缓加入 12 滴EME 培养基，保持20分钟后用吸管沿边缘小心移走 5. 从边缘再加入15滴EME 培养基，保持10分钟后小心移走。 6. 重复步骤5 两次 7. 最后加10-15滴BH3 培养基，在培养皿中央形成一小池，沿培养皿边缘加入15-20滴BH3 培养基，保持培养皿内的湿度，封口膜封口。 二）???????????? 电融合法 1. 将双亲原生质体用电融合液悬浮，混合备用（胚性愈伤组织原生质体1-5 x 105 个/ml； 叶肉原生质体10-20 x 105 个/ml）. 2. 融合小室先用融合液洗涤，以防原生质体聚集于电极两侧的角落里，然后取大约 0.8 ml （FTC-03）或 1.6 ml （FTC-04）悬浮液于环形融合小槽，融合小室中央加几滴电融合液以保持湿度，parafilm 封口。 3. 静置5-10分钟，待大量原生质体沉淀后，在选择好的电融合参数下诱导融合，倒置显微镜下观察融合过程。 4. 融合后，静置15-20分钟以利于融合的原生质体圆球化。 5. 轻轻吸出融合产物于10 ml 离心管中离心5-6 分钟，用培养基悬浮至0.5-1 x 105 个/ml . 六、原生质体培养 1. 原生质体培养常采用液体浅层培养或固体包埋培养法。 2. 原生质体培养在暗培养箱中进行，3-10天后原生质体再生细胞壁，并开始第一产次分裂。 3. 等原生质体分裂形成多细胞团时（大约20-30天），开始降低培养基的渗透压，具体：1） 各加入5-10滴0.6 M BH3和0.3M EME培养基，降压至0.45 M 2) 7 – 15 天后再各加入5-10滴0.6 M BH3和0.3M EME培养基，降压至0.3 M 3）此后要及时稀释，降低细胞团的浓度，以利于胚状体发生，等细胞团长到一定大小时，转入EME500上诱导胚状体的发生。 4）细胞团长出球形胚、心形胚后，及时转入EME 1500培养基上，以利于胚状体的进一步发育和转绿。 5）将发育到子叶胚时期的胚状体转入生芽培养基（MT+BA0.5mg/L+KT0.5mg/L+NAA 0.1mg/L）中诱导丛生芽。 6）将丛生芽转入生根培养基(1/2MT+IBA0.1mg/