RT-PCR_步骤.docVIP

一、组织抽提： 1.?????? 取组织块50-100㎎用液氮在研钵中研磨成粉末 2.?????? 移入玻璃匀浆器加入1ml Trizol 抽打匀浆 3.?????? 移入1.5ml新离心管用5 ml针头抽打 4.?????? 冰上5分钟 5.?????? 离心12,000g 4℃ 5分钟 取上清液移入1.5ml新离心管 6.?????? 加0.2 ml氯仿，震荡，冰上5分钟 7.?????? 离心12,000g 4℃ 10分钟 取上层液相移入1.5ml新离心管 8.?????? 加0.5 ml异丙醇，震荡，冰上孵育5分钟 9.?????? 离心12,000g 4℃ 5分钟 弃去上清液 10.?? 加入1 ml 75%乙醇，震荡 11.?? 离心7,500g 4℃ 5分钟 弃去上清液 12.?? 室温下使之变透明 13.?? 加入DEPC处理水10μl --35μl 溶解RNA（ 可保存在液氮或低温冰箱） 14.?? 走RNA变性电泳观察18s，28s条带，分光光度计检测260/280吸光度比值，计算RNA浓度 二、RT反应体系（第一步）：约20分钟 RNA 抽提物 5μl Radome 引物 2μl RNA sin 0.5μl 1.?????? 65℃ 15分钟2.?????? 立即放入冰浴 RT反应体系（第二步）：约2小时 RNA sin 0.5μl