SDS-PAGE电泳详解.ppt

SDS杨兵 主要内容： 一、SDS简介 二、实验试剂与器材 三、实验步骤 四、注意事项 一. SDS（简介） SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS） ： 什么是聚丙烯酰胺凝胶？ 加入SDS的作用？ SDS的用途？ SDS分离蛋白质的原理？ SDS的优缺点？ 垂直板电泳装置 样品迁移方向 加样 1.聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂N，N，N?，N?—四甲基乙二胺(TEMED)和催化剂过硫酸铵(AP)或核黄素的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子大小和形状等因素。 当向蛋白质溶液中加入足够量SDS，由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量， 因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别，SDS与蛋白质结合后，还可引起构象改变，蛋白质—SDS复合物形成近似“雪茄烟”形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，SDS消去了蛋白质电泳时的电荷和分子大小的因素，使蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。 2.加入SDS的作用： 3. SDS的用途： 主要用于测定蛋白质分子量。 当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式： logMW=K-bX 式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数。 若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。 丙烯酰胺浓度（%） 线性分离范围（kD）? 15 12～43 10 16～68 7.5 36～94 5.0 57～212 分子量范围与凝胶浓度的关系 4. SDS分离蛋白质的原理 分子筛效应：蛋白质分子在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中电泳时电泳迁移率主要取决于它的分子量，分子量越小，迁移率越快。 凝胶由分离胶和浓缩胶组成： 上层为浓缩胶，凝胶孔径较大，没有分子筛效应，其pH为6.8，由于快慢离子所形成的高电压梯度，使得变性蛋白质分子在泳动中被压缩为很薄的一层，大大提高了分辨率。 下层为分离胶，凝胶孔径较小，有分子筛效应，pH为8.8，变性蛋白质分子所带负电荷基本一致，泳动速度主要决定于分子量。 蛋白分子迁移规律：蛋白分子越小，迁移速率越快。 混合样品 带孔胶 按分子大小分离 电泳方向 电泳 小分子 大分子 5、SDS优缺点 优点：设备简单、快速、分辨率和灵敏度高， 特别适用于寡聚蛋白及其亚基的分析鉴定和 分子量的测定 。 缺点：有许多蛋白质是由亚基或两条以上肽链组成的（如血红蛋白、胰凝乳蛋白酶等），他们在变性剂和强还原剂的作用下，解离成亚基或单条肽链。因此，对于这一类的蛋白质，SDS测定的只是它们的亚基或单条肽链的分子量，而不是完整蛋白质的分子量。 二.实验试剂与器材 1.试剂： (1) 30%丙烯酰胺 (2) 10%SDS (3)分离胶缓冲液:3.0mol/L Tris-HCl pH 8.8 (4)浓缩胶缓冲液: 0.5mol/L Tris-HCl pH6.8 (5) 10%过硫酸铵(APS)溶液 (6) 四甲基乙二胺(TEMED) (7) 上样缓冲液:Tris-HCl、 SDS、溴酚蓝、甘油、 2-巯基乙醇 (8) 电极缓冲液（Tris-甘氨酸缓冲液） (9) 染色液:甲醇、水 、冰乙酸 、考马斯亮蓝R250 (10) 脱色液:甲醇、水 、冰乙酸 2.实验器材： 垂直板电泳装置 电泳仪 脱色摇床 移液枪 滤纸 大培养皿 垂直板电泳装置 电泳槽（1）、电泳架、灌胶架（2）、灌胶架夹（3）、橡胶垫（4）、长玻璃板（5）、短玻璃板（6）、样品梳（7）、加样器（8）。 三.实验步骤 1. 安装制胶模具。 2. 分离胶的制备与加入：按规定的比例制备分离胶；将分离胶充分混合后，小心倒入胶模中再在胶面上覆上一层水，水平静置至胶体凝固（室温不同，聚合时间不同）。 3. 倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干。 4. 浓缩胶的制备与加入：按规定的比例制备浓缩胶；倒入混合好的浓缩胶，插入梳子（注意避免气泡产生），梳子底部与分离胶的前沿距离约1cm，水平放置直到胶体凝固。 分离胶配制 试剂名称 12.5％浓