SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳详解.pptx

SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE电泳SDS-polyacrylamidegelelectrophoresisSDSSDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳实验目的理解SDS的基本原理掌握SDS技术理解SDS的基本原理掌握SDS技术操作流程制分离胶制胶制浓缩胶破碎细菌，提取蛋白质上样电泳凝胶染色凝胶脱色聚丙烯酰胺具有神经性毒性，可从皮肤、呼吸道吸入，要做好防护措施。制分离胶（每4人制一份）10%分离胶配方（10ml可制1块胶）按表中用量，在一个小烧杯里依次加入水，Acr/Bis，凝胶缓冲液，SDS，轻轻混匀；加入50uL10%APS(过硫酸铵)，轻轻混匀；加入5uLTEMED（四甲基乙二胺），轻轻混匀；用1ml移液器，将上述混合液加入制胶板中。注意，分离胶液面离玻璃板上沿约2cm（该空间用来制备浓缩胶），约3.3ml。从胶板的左右两侧缓慢各加入200ul去离子水，使分离胶上表面覆盖一层水，以隔绝空气，加速胶的凝固。水30%Acrylamide/Bis凝胶缓冲液(pH8.8)10%SDS(W/V)总体积4.1ml3.3ml2.5ml0.1ml10ml灌胶SDS电泳模具螺栓滑块灌胶室（上槽）玻璃板旋钮制胶架下槽上盖步骤2：制胶制浓缩胶（每4人制一份）4%浓缩胶配方待分离胶完全凝固（约30min，此时分离胶与水层有明显的分界线），倒掉水层，并用滤纸条吸干残余的水滴；如上表所示，在一个小烧杯里依次加入水，Acr/Bis，凝胶缓冲液，SDS，轻轻混匀；加入50uL10%APS，轻轻混匀；加入10uLTEMED，轻轻混匀；用1ml移液器，将上述混合液加入分离胶上层，插入梳子，室温放置约30-40min，待胶完全凝固。水30%Acrylamide/Bis凝胶缓冲液(pH6.8)10%SDS(W/V)总体积6.1ml1.3ml2.5ml0.1ml10ml破碎细菌，提取蛋白质（每人制1份）从管中吸取1ml菌液，12000rpm离心1min，弃上清，向沉淀中加入100ulPBS，涡旋震荡以充分悬浮细胞沉淀；吸取10ul蛋白样，加入10ul2×loadingBuffer，混匀（marker取5ul+10ul2×loadingBuffer，混匀），于95℃水浴加热15min。12000rpm离心2min，尽量取上清液待用。上样待凝胶完全凝固后，把凝胶固定架取出，垂直向上拔掉梳子。取下固定架（绿色部分），把凝胶连同前后玻璃一起固定在电泳槽里。向电泳槽加入1X电泳缓冲液至没过上样室。上样：蛋白样约20ul（10ul蛋白样+10ul2×loadingBuffer，混匀，点样。）marker约15ul（取5ulmarker+10ul2XloadingBuffer，混匀，点样。）每人跑一份蛋白样；每排（6人）点一块胶：每块胶最左边点一个蛋白marker。电泳先调100V/浓缩胶电泳，当指示染料进入分离胶后，调至60V/分离胶，电泳至蓝色距胶板下缘1cm为止。染色电泳结束后，取出凝胶室，用多用取胶器（钼红色标尺）撬开玻璃板取胶，剥离凝胶，去掉浓缩胶；将凝胶板浸入考马斯亮蓝染液摇床染色0.5-1h。脱色将已染色的凝胶板放入醋酸脱色液脱色1-2d，以背景无色为准。试剂用于制胶的试剂：丙烯酰胺(Acr)、N，N’一亚甲基双丙烯酰胺(Bis)、过硫酸铵(APS)，四甲基乙二胺(TEMED)、十二烷基硫酸钠（SDS）、二巯基苏糖醇（DTT）。缓冲液：Tris、HCl。上样缓冲液：Tris、HCl、蔗糖、溴酚蓝、SDS电泳缓冲液：Tris、甘氨酸。染色剂：考马斯亮兰R250浓度为2.5g/L，用甲醇∶醋酸∶蒸馏水=5∶1∶5的溶液配制（V/V）。脱色剂：醋酸取冰醋酸7.5ml、甲醇5ml，加蒸馏水至100ml。各试剂的作用Acr：Bis：Acr与Bis共同成为分子筛的主体。APS：催化剂TEMED：加速剂在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。DTT：还原剂，使半胱氨酸的二硫键断裂并被还原。SDS：为去污剂，断裂蛋白质的氢键，破坏蛋白分子的二、三级结构而去折叠成多肽。解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，从而消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。甘氨酸：由于pI=6.0,在pH=8.8是带负电，向正极泳动。因解离度小，有效迁移率很低，泳动慢。HCl：强电解质，Cl-有效迁移率大，泳动快。因此，蛋白质的有效迁移率介于甘氨酸与Cl-之间。考马斯亮蓝R-250：通过范德瓦尔键与蛋白质结合，它与不同蛋白质结合呈现出基本相同的颜色，与蛋白质反应虽然比较缓慢，但是可以被洗脱下去，常用来对电泳条带染色。醋酸：促凝胶脱去蓝色，使背景干净。SDS的实验