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Western blot 方法步骤 蛋白质样品的制备 1. 把组织剪切成细小的碎片。 2. 取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。 3. 按照每20毫克组织加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。 4. 用匀浆机匀浆，直至充分裂解。 5. 充分裂解后，12000g离心5分钟，取上清，即可进行后续Western操作。 6.BCA测定蛋白浓度。将所有蛋白统一浓度（如4ug/ul）。将蛋白小份分装。 7.将蛋白与5×上样buffer混合，如4ug/ul蛋白，上样40ug，须蛋白10ul,则加入5×上样buffer2.5ul。沸水煮5min。 BCA测定蛋白浓度方法 1.将BCA试剂盒中A（碱溶液）与B（4%硫酸铜溶液）成分按50：1比例混合。 2.将标准蛋白等比稀释5-7个点。 3.取200ulA与B的混合液，加入20ul的以上稀释好的标准蛋白（作为标准曲线），及20ul的待测样品。37度摇床30min。 4.酶标仪检测。 二、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 制胶 分离胶制备 按顺序将水、30%丙烯酰胺、1.5M Tris(PH=8.8)、10%SDS、10%过硫酸铵及TEMED混合均匀。灌入玻璃片夹中。加无水乙醇封胶。等待胶凝，30-60min。 丙烯酰胺浓度（％） 线性分离范围（KD） 15 10~43 12 12~60 10 20~80 7.5 36~94 5.0 57~212 制备浓缩胶 按顺序将水、30%丙烯酰胺、0.5M Tris(PH=6.8)、10%SDS、10%过硫酸铵及TEMED混合均匀。灌入玻璃片夹中。立即插入梳子，用力要均匀，避免气泡的产生。等待胶凝，10min左右。拔掉梳子。将胶孔用自来水冲洗，赶走气泡，将水甩掉，用卫生纸擦干。 预电泳 将胶板装入电泳装置，短片玻璃朝内，加入1×电泳缓冲液至没过铁丝线。80V,预电泳10min。 4. 上样 用10ul的枪将处理好的蛋白质样品缓缓加入胶孔内，上样量不要超过25ul。样品两边加入1×上样缓冲液压边。不要忘记加入maker(6ul maker,用1×上样缓冲液补齐其余量)。 5.电泳 样品在浓缩胶中用80V，大概20-30min。在分离胶中120V。至溴酚兰跑到胶外。 转膜（湿转） 1×转膜缓冲液与甲醇按4：1混合。将海绵垫子、滤纸和胶板放入装有上述混合液的磁盘中。 制备三明治 将PVDF膜，浸入甲醇中，再放入转膜缓冲液中。将转膜的夹子黑色面向下放置，从下至上一次铺好海绵垫子、滤纸、胶、膜、滤纸和海绵垫子。注意不要产生气泡。 装好转膜装置，注意正负极。 加入1×转膜缓冲液与甲醇按4：1的混合液，至bloting线。160mA，转膜。 分子大小（KD） 转膜时间(H) 80---140 1.5-2.0 25---80 1.5 15—40 0.75 20 0.5 拷马斯亮蓝染胶 染胶：电泳结束后取出胶，置于拷马斯亮蓝溶液中，于室温摇床1H。 脱色：将胶置于脱色液中，室温摇床过夜。 立春红染色 取出膜剪去一角做标记正面向上。 丽春红染色，摇床上震摇，直至出现条带，蒸馏水冲洗。 封闭 脱脂奶粉（10%，用TBST稀释）4度过夜或者37度2H。如果是磷酸化的蛋白，需要用BSA。 一抗杂交 一抗：将膜放置于折叠好的封口膜中，加入一抗，用含有10%脱脂奶粉的TBS溶液稀释抗体。4度过夜，或者37度2H。 清洗：将膜放置装有TBST的溶液中，放于摇床上，清洗20min/次，3次。 二抗杂交 二抗：将膜放置于折叠好的封口膜中，加入二抗，用含有5%脱脂奶粉的TBS溶液稀释抗体。37度1-2H。 清洗：将膜放置装有TBST的溶液中，放于摇床上，清洗20min/次，3次。 ECL显色 ECL溶液配置 A+B=1:1混合。凝胶成像系统成像。 洗膜 striping buffer放置与50度水浴中温浴，将膜放入striping buffer中，摇床15-20min。TBST洗膜，3次，每次10min。 十一、封闭、β-actin一抗杂交、二抗杂交及ECL显色。 Tris—甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶溶液 溶液成分 5ml 10ml 15ml 20ml 25ml 30ml 6% 水 2.6 5.3 7.9 10.6 13.2 15.9 30%丙烯酰胺 1 2 3 4 5 6 1.5MTris(PH=8.8) 1.3 2.5 3.8 5 6.3 7.5 10%SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 10%过硫酸铵 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 TEMED 0.004 0.008 0.012 0.016 0.02 0.024 8%