ELISA试剂及操作步骤.docVIP

操作方法 1、包被：用包被液CBS稀释至为，酶标板中每孔加入50μl，室温过夜包被。 2、洗涤：弃包被液，用洗涤液1×PBST洗板3次，每次3min~5min。 3、封闭：每孔加封闭液250μl，37℃封闭2h。 4、洗涤：用洗涤液1×PBST洗板3次，每次3min~5min。 5、结合一抗：用1×PBST缓冲液1∶100稀释被检血清，每孔50μl，阴性对照，37℃孵育1.5h。 6、洗涤：同上。7、结合二抗：每孔加用1×PBST 500倍稀释的酶标二抗（）50μl，37℃孵育1.5h。 8、洗涤：同上。 9、显色：每孔加底物溶液50μl 配10ml ，置室温暗盒内显色10min。 10、待显色后，每孔加入50μl终止液（2mol/L H2SO4）终止反应。使用酶标仪读取49nm的OD值，以确定血清抗体水平。ELISA检测所用主要试剂： 包被缓冲液：0.05mol/L，pH9.6碳酸盐缓冲液（CBS） NCO3 l.59g NaHCO3 2.93g 加去离子水水至1000ml，调pH值到9.6。15磅高压灭菌20min后，室温贮藏。 磷酸盐缓冲溶液（1×PBS）：0.01 mol/L、pH7.4 NaCl 8.0g KPO4 0.2g KCl 0.2g Na2HPO4·12H2O 2.9g 溶于900ml去离子水后，调节pH至7.4，定容到1L。15磅高压灭菌20min后，室温贮藏。 10×PBS：0.2 mol/L、pH7.4 NaCl 80g KH2PO4 2.4g KCl 2.0g Na2HPO4·12H2O 36.05g 或Na2HPO4 14.4g 溶于900ml去离子水后，调节pH至7.4，定容到1L。15磅高压灭菌20min后，室温贮藏。 洗液：含0.05% Tween20的0.01 mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液 PBST 。 封闭液：0.5% 聚乙烯醇酶标二抗溶液：用PBST适当稀释辣根过氧化物酶标记。 底物溶液：OPD--磷酸盐缓冲液 A液 0.1mol/L柠檬酸 ：柠檬酸19.2g加去离子水至1L。15磅高压灭菌20min后，室温贮藏。 B液 0.2mol/L Na2HPO4溶液 ：NHPO4·12H2O 71.6g加去离子水至1L。15磅高压灭菌20min后，室温贮藏。 10ml底物液，取A液2.43m1, B液2.57m1，去离子水5m1，加OPD 4mg充分混匀溶解。加入15μl 30%H2O2后，配好后即刻使用。 终止液 2mol/L SO4 ：把109ml浓硫酸缓慢加入891ml去离子水中，边加边不断搅拌，以利于散热。