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SDS 凝胶制备 准备洁净的玻璃板、灌胶槽、隔板、无尘擦拭纸等试剂； 将玻璃板、隔板依次放进灌胶槽，安装好堵漏、固定螺丝等以确保不会发生渗漏，将灌胶槽放置水平面上等待灌胶； 进行双向电泳，常规选择12.5%的SDS胶，按照前述配方首先将Monomer stock solution、Tris-HCl、SDS、Milli-Q水混合，避光条件下在磁力搅拌器上边搅拌边使用负压抽气15分钟，再加入APS和TEMED搅拌混匀； 将混合均匀的凝胶溶液缓缓注入灌胶槽，液面高度至玻璃板上缘5-10mm，避免产生气泡； 在胶液面上缓缓加入水饱和正丁醇（Water saturated butanol）将胶面压平，灌好的凝胶在室温静置10 ~ 12个小时待其充分聚合； 为慎重起见，进行第二向电泳前，先观察凝胶是否聚合均匀、胶面是否平整、有无气泡等，再开始准备下一步实验。 IPG胶条的平衡 分别配制每10ml含有DTT 100mg或IAA 250mg的SDS equilibration buffer； 第一步平衡，在每个装IPG胶条的平衡管中加入10ml含DTT的SDS equilibration buffer，在轨道摇床上缓慢摇动平衡15 min； 第二步平衡，在每个装IPG胶条的平衡管中加入10ml含IAA的SDS equilibration buffer，在轨道摇床上缓慢摇动平衡15 min。 2-DE的第二向SDS 配制SDS电泳缓冲液： 上槽 cathode ：SDS electrophoresis buffer 10× 120ml稀释至700ml， 下槽 anode ：SDS electrophoresis buffer 10× 350ml稀释至3500ml； 使用上槽电泳缓冲液配制琼脂糖封胶液（Agarose sealant、Upper chamber agarose sealant）并加热熔解； 用纯水清洗掉SDS凝胶玻璃板上的碎胶和胶面上的水饱和正丁醇，加入上槽电泳缓冲液以平衡胶面； 准备4mm×8mm大小的滤纸片，在上面滴加标准分子量Marker 10μl后备用； 首先将下槽电泳缓冲液约3500ml倒入电泳槽，打开电泳液循环泵和水浴循环泵，将水浴循环温度设置为10℃。 倒去SDS凝胶面上的电泳缓冲液，用滤纸彻底吸干，将温热的Agarose sealant注入胶面上缘空隙直至填满； 平衡好的IPG胶条在上槽电泳缓冲液中略微漂洗一下，剪去两端多余的支持膜，在无尘擦拭纸上沾去多余缓冲液后，水平放置在SDS凝胶上缘并贴紧玻璃背板，用洁净的尺子将胶条压入Agarose sealant，使IPG胶条水平的附在SDS凝胶上缘，如有气泡需挤出； 在IPG胶条旁插入带有标准分子量Marker的滤纸片后，再次用温热的Agarose sealant将胶面上缘因放置IPG胶条而产生的空隙填满； 将放置好IPG胶条的SDS凝胶板依次插入电泳槽，待Agarose sealant冷却凝固后，将上槽（Upper chamber）湿润后水平的压进电泳槽内； 用Upper chamber agarose sealant将上槽与凝胶板的接缝处填充，待凝固后即可较好的防止上、下槽间的渗漏； 缓缓加入少量上槽电泳缓冲液，确认无渗漏后，加入剩余的上槽电泳缓冲液； 接好电泳槽电极，检查无误后打开电泳仪电源，SDS程序设置： 第一步：20mA，15min 第二步：60mA，直至胶内电泳指示剂（Bromophenol blue）跑出凝胶下缘；二向电泳结束后，小心的从电泳槽中取出凝胶板，标记和记录与IPG条相应的二向胶样品编号，需进行染色的凝胶使用专用的尺子将玻璃前板撬开、移去，纯水冲洗掉胶面残留的电泳缓冲液和碎胶后，立即使用染色的固定步骤固定凝胶内的蛋白质斑点； 附表：凝胶配方 Gel Concentration 5% 7.5% 10% 12.5% 15% Monomer stock solution 16.7ml 25ml 33.3ml 41.7ml 50ml Tris-HCl 1.5M, pH8.8 25ml 25ml 25ml 25ml 25ml SDS 10% 1ml 1ml 1ml 1 ml 1ml Milli-Q water 56.8ml 48.5ml 40.2ml 31.8ml 23.5ml Ammonium persulfate 10% 500μl 500μl 500μl 500μl 500μl TEMED 33μl 33μl 33μl 33μl 33μl Total volume 100ml 100ml 100ml 100ml 100ml LWM配制 0.5% agarose: 0.1g agarose + 20ml上槽电