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Silica硅石粉法纯化质粒 【实验原理】 Silica硅石粉在一定的条件下可以选择性的吸附DNA。在水溶液中DNA 分子带负电荷，Silica表面的硅氧键水化后带负电荷，DNA 分子和硅胶之间产生静电排斥，Silica硅石粉不能结合DNA，当溶液中含有高浓度的阳离子时，阳离子在DNA与Silica硅石粉表面形成阳离子桥，DNA吸附在Silica硅石粉表面 但Silica不结合蛋白质、寡聚核苷酸、有机溶剂、去污剂及其它可能抑制酶活性的有机物或无机物 ，当溶液离子浓度再次降低时，水分子破坏了Silica硅石粉表面阳离子桥，Silica硅石粉表面再次水化带负电荷，DNA从Silica硅石粉表面解吸，释放到溶液中 图1-1 。 利用Silica硅石粉纯化质粒DNA时，首先时利用了碱法提取质粒DNA，再在高盐条件下利用Silica硅石粉特异性地吸附质粒DNA，并用70%乙醇溶液洗去不被Silica硅石粉吸附的杂质 包括蛋白质和多糖等物质 ，最后利用纯水处理silica硅石粉，解吸Silica硅石粉上吸附的质粒DNA，获得高纯度的质粒。用Silica方法纯化DNA，无需酚抽提，DNA回收率高，纯度满足DNA酶切、测序、连接、转化和体外转录等操作等分子操作。 图 1-1 Silica硅石粉吸附和解吸DNA 【器材与试剂】 1．实验器材 参见实验1。 2．材料与试剂 1 Silica硅石粉悬液 称取5g Silica硅石粉 Sigma产品，货号 S-5631 ，加20 mL H2O，完全悬浮Silica硅石粉，然后静置2h，轻轻的倾去混浊的悬液 保留沉淀 ，重复清洗沉淀3次，用20 mL H2O悬浮Silica硅石粉，4℃保存备用。 2 溶液Ⅰ 含50 mmol/L Tris-Cl，10 mmol/L EDTA pH7.5~8.0 和10mg/ mL RNaseA。 3 溶液Ⅱ 含0.2 mol/L NaOH和1% m/V SDS。 4 溶液Ⅲ 4 mol/L KAc pH4.8 5 6 mol/L 盐酸胍 6 70% V/V 乙醇 【操作步骤】 1．取1.5 mL过夜培养的菌液于1.5 mL Eppendorf管中，以5,000 r/man的转速，离心1 min，弃去上清。 2．加入200 μL溶液Ⅰ，涡旋，充分悬起细胞沉淀。 3．加入200 μL溶液Ⅱ，轻轻颠倒混匀，放置5 min。 4．加入200 μL溶液Ⅲ，轻轻混匀，以12,000 r/min的转速，离心10 min。 5．取上清液至新1.5 mL Eppendorf管中，加入6 mol/L 盐酸胍600 μL，混匀后，再加入50 μL Silica硅石粉混匀。 6．以12,000 r/min的转速，离心3 min，弃去上清液。 7. 加入70% V/V 乙醇1 mL，充分悬起Silica硅石粉，以12,000 r/min的转速，离心3 min，弃去上清液。 8．重复操作步骤7。 9．干燥沉淀10 min。 10．加入50 μL无菌水，65℃水浴5 min。 11．室温下，以12,000 r/min的转速，离心5 min。 12．取上清液至新的Eppendorf管中，-20℃储存。 【要点提示】 1．加入溶液Ⅱ、Ⅲ后，轻轻颠倒混匀，防止基因组DNA断裂，此过程与碱法提取质粒DNA一致。 2．在步骤8中，尽量吸干酒精，不然酒精会影响下游操作。 3．65℃水浴有利于质粒充分从Silica硅石粉上解吸，提高质粒DNA的回收率。 【思考题】 1．实验中，盐酸胍的作用是什么？ 2．水浴的作用是什么？用沸水浴解吸质粒可否？ 3. 本实验中，样品中的RNA是如何除去的?