TA克隆-T载体.docVIP

TA 克隆概述 TA 克隆载体即 T 载体，是目前克隆 PCR 产物最简便、快捷的方法。随着基因组计划的进行，以及分子生物学技术、基因芯片技术在生命科学研究、生物工程和医学等领域的应用，对 TA 载体的需求量会逐步扩大 TA 克隆方法（ Original TA Cloning Kit ）即利用 Taq 聚合酶同时具有的末端连接酶的功能，在每条 PCR 扩增产物的 3` 端自动添加一个 3`-A 突出端。利用 TaKaRa 的 T 载体，直接高效地连接 PCR 产物。 所以 TA 克隆不需使用含限制酶序列的引物，不需将 PCR 产物进行优化，不需把 PCR 产物做平端处理，不需在 PCR 扩增产物上加接头，即可直接进行克隆。 原理如下： TA克隆的策略 摘要： 对于亚克隆来说，酶切-连接可谓是最经典的方式。虽说效果不错，可着实有些麻烦。载体和片段分别酶切、跑胶、回收，再加上连接和转化，一星期转眼就过去了。新的克隆方法也在不断涌现。速度更快，片段更长。生物通近期就将盘点一下市场上一些非一般的克隆。从TA克隆开始，我们着重于一些容易忽视的问题。 TA 克隆的 idea 最初来自 1994 年。几位学者发现Taq DNA 聚合酶会在PCR 产物的3’末端加上一个脱氧腺苷（A），而且这种特性与模板无关。之后，Invitrogen 公司发明了 TA 克隆技术，并拥有全球 TA cloning 商标的专利权，直至 2013 年。（这个就够他们赚得盆满钵满了。）线性化的 T 载体在 3’末端拥有一个脱氧胸苷（T），与 PCR 产物的 A 尾巴互补。原理就是这么简单。不过由于价格的原因，Invitrogen 的 T 载体在国内却不是销量最好的。Promega 的 pGEM-T（easy）和 Takara的 pMD18-T 因性价比高，更加深入人心。 TA 克隆的步骤无需赘述，相信大家都很清楚。无非就是 PCR、连接、转化、鉴定这几个步骤，不过还有一些不得不说的问题，值得大家注意。 用什么样的聚合酶？ 不是所有的聚合酶都会在PCR 产物末端加A。具有 3’到 5’外切酶活性的高保真酶就不会产生 A尾巴。如果你下一步想要做基因表达，一定要用高保真酶，那也没问题。只要用 Taq 酶在产物末端加个 A 就 OK。步骤也很简单，根本无需买个什么加A 试剂盒，几步就搞定了。 1. 用高保真酶扩增完之后，在反应管中加入0.7-1 unit 的 Taq 聚合酶。无需更换 buffer，其中的 dATP 已经够用。 2. 在 72℃孵育 8-10 分钟。3. 立即进行纯化，沉淀、跑胶、或用纯化试剂盒。这一点相当重要，否则高保真聚合酶会将 A尾巴或 T 载体上的 T 尾巴切掉。 有些高效率的聚合酶其实是 Taq 酶和高保真酶的混合物，大约有一半的产物加了 A 尾巴。所以你在克隆之前最好搞清楚你用的酶到底是否加A，否则克隆出来白斑太少，又要讨论好久。 PCR 产物的纯度 如果你的 PCR 产物只有唯一条带，恭喜你。不过为保险起见，最好还是用 PCR 产物纯化试剂盒来纯化一次。否则白色菌落中的插入片段可能是引物二聚体哦。如果你发现有非特异条带，那最好优化一下 PCR 反应，让非特异条带消失。跑胶纯化是下策，因为胶纯化可能会带走 3’的 A 尾巴。而且注意不要在紫外灯下暴露太久。只需 5 秒，紫外对 DNA 的伤害就足以检测；而长达 60 秒的照射会让某段序列在测序时无法读取。问题远比你想象中严重。 生物通提示：PCR 产物其实也有保质期。为了保证连接效率，PCR产物最好不要超过一天。因为上面的 A 尾巴会随着时间逐渐降解，导致连接效率下降。千万不要为了省事，就整个一大管PCR 产物，每次用一点。最终反而更浪费时间。 载体和片段的比例 往往是影响克隆效果的最大因素。通常来说，载体与片段的起始摩尔比为 1：1。计算方法如下： X ng PCR 产物 （ng 载体 × kb 片段大小）/ kb 载体大小 如果这样的比例不能令你满意，你可以在 3：1 到 1：3 的范围内进行优化，选择最佳的比例。PCR 产物的浓度可以通过与 Marker 比对估算出来。还有一种更准确的方法，用 GE 的 NanoVue超微量分光光度计。只需要 0.5 ul，就能测量出样品浓度，你再也不用舍不得珍贵的样品了。0.5 ul而已，小意思。对照 托尔斯泰曾说过：“幸福的家庭总是相似的，不幸的家庭各有各的不幸。”实验也是如此。失败的实验总有各种各样的缘由。对照在实验失败时就凸显其重要性了。 阳性对照 一般在购买 TA 克隆的 kit 时，都会附带阳性对照。你应该在第一次实验的时候，就按照说明书上对照反应的步骤，同时进行阳性对照，以检验PCR