分子生物学2011385003谭刚.docVIP

写出一个研究功能基因组的思路 研究功能基因组的思路分为三个重要阶段,第一个阶段是目的基因的精细定位,第二个阶段是目标候选基因的功能验证，第三个阶段是基因的功能与基因进化研究。 由于基因在基因组中有相对稳定的基因座位，在不清楚基因序列与所编码的蛋白序列信息的情况下，先利用分子标记技术（如Indel、SSR、SNP） RT-PCR qRT-PCR RT-PCR 为反转录RCR（reverse transcription PCR）和实时PCR（real time PCR）共同的缩写。逆转录PCR，或者称反转录PCR reverse transcription-PCR, RT-PCR ，是聚合酶链式反应 PCR 的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。 实时PCR real-time PCR ，属于定量PCR（Q-PCR）的一种，以一定时间内DNA的增幅量为基础进行DNA的定量分析。 　　real time PCR 的定量使用荧光色素，目前有二种方法。一种是在ds DNA中插入特异的荧光色素，例如SYBR Green荧光染料；另一种使用一种能与增幅DNA序列中特定寡核酸序列相结合的一种荧光探针（probe），如Taqman探针。两种方法原理不同。SYBR Green荧光染料游离时不发光，当反应体系中存在双链DNA时，SYBR Green与双链DNA结合，此时才发光。Taqman探针带有一个荧光基团和一个淬灭基团，荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭基团则在3’末端。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5－3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，此时荧光基团发出的荧光信号可以被检测到。 　　real time PCR 与 reverse transcription PCR 相结合，能用微量的RNA来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。这两种RT PCR的组合又被称之为“定量RT-PCR（quantitative RT-PCR）”原位杂交技术in situ hybridization）的基本原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性或非放射性的外源核酸 即探针 与组织、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。为显示特定的核酸序列必须具备3个重要条件：组织、细胞或染色体的固定、具有能与特定片段互补的核苷酸序列 即探针 、有与探针结合的标记物 曾呈奎等2000 。 RNA原位核酸杂交又称RNA原位杂交组织化学或RNA原位杂交。该技术是指运用cRNA或寡核苷酸等探针检测细胞和组织内RNA表达的一种原位杂交技术。其基本原理是：在细胞或组织结构保持不变的条件下，用标记的已知的RNA核苷酸片段，按核酸杂交中碱基配对原则，与待测细胞或组织中相应的基因片段相结合 杂交 ，所形成的杂交体 Hybrids 经显色反应后在光学显微镜或电子显微镜下观察其细胞内相应的mRNA、rRNA和tRNA分子。RNA原位杂交技术 经不断改进，其应用的领域已远超出DNA原位杂交技术。尤其在基因分析和诊断方面能作定性、定位和定量分析，已 成为最有效的分子病理学技术，同时在分析低丰度和罕见的mRNA表达方面已展示了分子生物学的一重要方向。 DNA microarray DNA微阵列技术是产生于90年代的一种分子生物学技术，也称为芯片技术，其原理是：在一块带有DNA微阵列涂层的玻璃片上，利用光导化学合成、照相平板印刷、固相表面化学合成等技术合成数百万个DNA探针，然后与用荧光或放射性同位素标记的DNA杂交，继而通过荧光强度或者同位素放射强度检测技术检测杂交信号强弱，从而确定细胞中特定分子的相对表达水平。 4染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）也称结合位点分析法，是研究体内蛋白质与DNA相互作用的有力工具，通常用于转录因子结合位点或组蛋白特异性修饰位点的研究。将ChIP与第二代测序技术相结合的ChIP-Seq技术，能够高效地在全基因组范围内检测与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段。ChIP-Seq的原理是：首先通过染色质免疫共沉淀技术（ChIP）特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，并对其进行纯化与文库构建；然后对富集得到的DNA片段进行高通量测序。研究人员通过将获得的数百万条序列标签精确定位到基因组上，从而获得全基因组范围内与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段信息。酵母单杂交系统（Yeast one-hybrid s