大肠杆菌的冷冻干燥保存1.docVIP

郑老师，这是我的安排 星期四上午 准备试剂与各种器械的灭菌，制备培养基 星期四下午 活化菌种与斜面琼脂 星期五上午 接种于LB培养基中，37C培养 星期五下午 星期六上午 涂片检查有无杂菌污染，然后冷冻干燥保存。 星球六下午 这个时间只是初步的，郑老师您看行不行，我现在除了周二有课外其它差不多都没课了。 还有，我也不知道这个安排合不合适，有什么问题，还请老师指出来。 步骤： 1各种物品的准备与高温蒸汽灭菌 2 菌种的培养： LB液体培养基24H 3离心 4有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。 5真空冷冻干燥。 大肠杆菌的冷冻真空干燥法【试剂与器材】1．菌种 2．培养基 3．溶液或试剂 脱脂奶粉 4．仪器或其他用具 无菌滴管，冻干管，普通冰箱，低温冰箱 -30 、离心机、离心管、锥形瓶、试管、灭菌锅、烘干箱等 。【操作步骤】1．准备冻干管 用蒸馏水冲洗1～2次，121℃灭菌30min。配制保护剂 将脱脂奶粉配成%乳液, 11，灭菌min,随机抽样进行无菌检查,确认无菌后方可使用。 3．培养菌种 将要保存的菌种接入培养基中，±1°?培养24h±1°?培养24h. 4．。 分装样品 用吸取冻干管每管装约2ml 7．预冻 冻干管放于中，-30℃冰柜冷冻h-48h即可。 ．冷冻真空干燥 启动冷冻真空干燥机制冷系统。当温度下降到-50以下时，将冻结好的样品迅速放入冻干机钟罩内，启动真空泵抽气直至样品干燥。．取出样品 先关真空泵、再关制冷机，打开进气阀使钟罩内真空度逐渐下降，直至与室内气压相等后打开钟罩，取出样品。先取几只冻干管在桌面上轻敲几下，样品很快疏散．说明干燥程度达到要求。若用力颠，样品不与内壁脱开，也不松散，则需继续冷冻真空干燥，此时样品不需事先预冻。．熔封 用高频电火花真空检测仪检测冻干管内的真空程度。当检测仪将要触及冻干管时，发出蓝色电光说明管内的真空度很好，便在火焰下 氧气与煤气混合调节，或用酒精喷灯 熔封冻干管。 11．检测存活性 每个菌株取1支冻干管及时进行存活检测。打开冻干管，加入0.2m1无菌水，用毛细滴管吹打几次，沉淀物溶解后 丝状真菌、酵母菌则需要置室温平衡30 min～60min ，转入适宜的培养基培养，根据生长状况确定其存活性，或用平板计数法或死活染色方法确定存活率,如需要可测定其特性。 ．保存 置4或室温保存 前者为宜 。隔时进行检测。．取用冻干管时，先用75％乙醇将冻干管外壁擦干净，再用砂轮或锉刀在冻干管上端画一小痕迹，然后将所画之处向外，两手握住冻干管的上下两端,稍向外用力便可打开冻干管，或将冻干管近口烧热，在热处滴几滴水，使之破裂，再用镊子敲开。【注意事项】样品干燥的程度对菌种保存的时间影响很大。一般要求样品的含水量为1%～3%，判断方法：外观 样品表面出现裂痕，与冻干管内壁有脱落现象，对照管完全干燥；指示剂 用30g/L的氯化钴水溶液分装冻干管，当溶液的颜色由红变浅蓝后，再抽同样长的时间即可。