三、质粒DNA的提取和电泳鉴定要点.pptVIP

质粒DNA的提取和酶切鉴定 实验三 实验目的 掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理和方法 掌握质粒的酶切鉴定 实验原理 碱裂解法是利用质粒DNA与染色体DNA在变性与复性中的差异来达到分离的目的。 染色体DNA 质粒DNA 实验原理 当菌体在NaOH-SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA会发生变性。加入中和液（乙酸钾）后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；而染色体DNA、大分子RNA以及蛋白质-SDS复合物等形成沉淀，可通过离心去除。 实验步骤 在含相应抗生素（Amp）的LB中接入一单菌落（白色），于37℃剧烈振摇下培养过夜。 取1.5ml对数生长期的菌体于Eppendorf管中，8000rpm离心1min，收集菌体。 弃上清液，将EP管倒置在吸水纸上，吸干溶液。 加入100μl GTE缓冲液，轻轻吹打重悬菌体，室温放置5min。 加入200μl新鲜配制的NaOH-SDS（100μl 2mol/L NaOH+100μl 10%SDS+800μl 双蒸水）溶液，颠倒混匀10次，冰浴5min。动作轻柔，同时控制好时间！ 加入150μl预冷的乙酸钾溶液，充分颠倒混匀，冰浴5min。一定要充分混匀！ 7. 4℃，12000rpm离心5min，取上清300μl 转移至另一支新的EP管中。 8. 加等体积异丙醇，冰浴20min，12000rpm离心5min，弃上清液。 9. 缓慢加入70%乙醇0.5ml，轻轻上下颠倒， 12000rpm离心1min，吸弃大部分上清，挥干剩余乙醇。注意不要吹打沉淀！最后沉淀不要过于干燥！ 10. 用10μl 含有RNase的TE溶液溶解沉淀的DNA，37 ℃ 水浴10min，以降解RNA分子 。 实验步骤 试剂中的主要成分和作用 GTE缓冲液： Tris-HCl溶液：调节pH。 葡萄糖：使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子底部。 EDTA：二价金属离子螯合剂，抑制DNase活性。 NaOH-SDS溶液： NaOH：溶解细胞，破坏核酸碱基配对使氢键断裂从而让核酸变性。 SDS：裂解细胞，结合蛋白质，形成SDS-蛋白质复合物。 乙酸钾溶液： 乙酸：中和NaOH，使质粒DNA复性为可溶性DNA。 钾离子：置换了SDS的钠离子形成不溶性的PDS，将基因组DNA和蛋白质沉淀下来。 试剂中的主要成分和作用 RNase溶液：水解上清中小分子RNA。 异丙醇：快速沉淀质粒DNA，但难以挥发。 70%乙醇：去除异丙醇，且易于挥发除去。 TE缓冲液：溶解质粒DNA沉淀，含有EDTA 能够使DNA保存时间更长。 试剂中的主要成分和作用 注意事项 NaOH-SDS溶液处理时间不能太长，且不能激烈震荡，否则会断裂基因组DNA使之混入质粒DNA中。 加入预冷乙酸钾后要充分颠倒混匀，以中和NaOH，沉淀蛋白质和染色体DNA等。 70%乙醇洗涤时不要吹打质粒DNA沉淀，否则DNA会溶解在水中。同时DNA沉淀不能太过干燥，否则影响TE溶液溶解。 实验原理1. DNA的限制性酶切反应的原理 限制性内切酶（restriction enzyme 是一类识别DNA上特异核苷酸序列并产生切割反应的核酸内切酶 endonμclease 的总称。 它能够识别并结合双链DNA分子中特异的核苷酸序列，在该序列内部水解核苷酸之间的3,5-磷酸二酯键，切断DNA双链结构。 限制性内切酶识别的DNA序列一般长度为4~6个核苷酸，具有回文结构（双链DNA中含有的二个结构相同、方向相反的序列，或称为反向重复序列 ）特征。 2. 质粒的酶切鉴定： 质粒DNA酶切反应体系 10?酶切buffer 1 ?l 质粒DNA 5 ?l EcoR1（10u/?l） 1 ?l BamH1（ 10u/?l ） 1 ?l ddH2O加至 10 ?l 37℃水浴保温1h；72 ℃水浴15min终止反应。 3.电泳检测目的基因片段 配制1%琼脂糖凝胶：1g琼脂糖粉末+100mlTAE缓冲+5ulGoldView/gelred染料。上样24ul（10ul 质粒DNA+2ul 6×Loading Buffer），120V稳压电泳鉴定质粒DNA. 4.结果分析 实验和作业要求 实验报告在下次实验课前由学习委员统一收齐上交。 实验报告：原理（不要照抄实验手册） 实验方法（可附加流程图） 结果（电泳鉴定需要附图） 讨论（实验失败要分析原因） * SDS:十二烷基磺酸钠，是一种很强的阴离子表面活性剂，能破坏蛋白质分子结构 * * SDS:十二烷基磺酸钠，是一种很强的阴离子表面活性剂，能破坏蛋白质分子结构 *