protocole mutant.docVIP

Mutagenèse par insertion du plasmide pVO155 __________________________________________________________ 1. Amplification PCR d’un fragment de gène a. Choix des amorces PCR - Copier la séquence du gène à muter dans un fichier texte à partir du site web de S. meliloti (http://bioinfo.genopole-toulouse.prd.fr/annotation/iANT/bacteria/rhime/) - Rechercher la présence de sites de restriction BamHI (GGATCC) et XbaI (TCTAGA) sur la séquence du gène - Définir des amorces à l’aide de ??Primer 3?? sur le gène à muter, si possible dans la première moitié du gène et dans une région ne comprenant pas de sites BamHI et XbaI (si ce n’est pas possible remplacer BamHI par SalI) la taille du produit PCR doit faire entre 300 et 400 bp le Tm des primers doit être autour de 60°C - Ajouter des extensions aux amorces comportant des fragments de restriction BamHI (CGGGATCC) et XbaI (GCTCTAGA) - commander les amorces ainsi définies b. PCR Dans un tube 0.5 ml, ajouter?: matrice?: ADN génomique 1 ul Primer 1 (10 ?M) 10 ul Primer 2 (10 ?M) 10 ul Tampon 10X 10 ul MgCl2 (50 mM) 3 ul dNTPs (10 mM) 2 ul Taq 1 ul H2O 67 ul Programme?: 95°C 5 min 95°C 45 sec 55°C 30 sec 30 cycles 72°C 30 sec 72°C 10 min 15°C maintien c. Dép?t sur gel - Déposer 10 ?l du produit d’amplification sur un gel d’agarose 2% dans du tampon TAE 1X. - Vérifier que les produits PCR sont de la bonne taille. 2. Purification des produits PCR - Purifier les 90 ?l de PCR non déposés, à l’aide d’un kit de purfication?: Qiaquick PCR purification kit (Qiagen) ou Wizard (Promega) Dans tous les cas suivre les instructions du kit. Volume d’élution = 50 ?l 3. Digestion des produits PCR purifiés - Mélanger?: 24 ?l de PCR 1.5 ?l BamHI 1.5 ?l XbaI 3 ?l Tampon react 6 (Invitrogen) - Incuber 3h dans un bain marie à 37°C 4. Purification des produits de PCR digérés - Purifier la totalité des produits de digestion à l’aide d’un kit de purfication Qiagen ou Promega Volume d’élution = 50 ul -