紫外分光光度法测蛋白酶酶活.docVIP

紫外分光光度法?1、原理 蛋白酶在一定的温度与H条件下，水解酪素底物，然后加入三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪素沉淀除去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定。根据吸光度计算其酶活力。1mL粗酶液，在一定温度和H值条件下，1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位，以（u/mL）表示。 2试剂和溶液 2? 三氯乙酸c（CC3·COOH） 0.4mol/L 称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。 2? 氢氧化钠溶液c（NaOH） 0.5mol/L 按GB601配制。 2? 盐酸溶液c（HC）＝1 mol/L及0.1 mol/L 1 mol/L:取90mL浓盐酸溶解于去离子水中，定容至1000mL。 0.1 mol/L HＣＬ：取9mL浓盐酸溶解于去离子水中，定容至1000mL。 2.4? 缓冲溶液 a、磷酸缓冲液（H＝7.5）适用于中性蛋白酶 称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4·12H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。 b、乳酸缓冲液（H＝3.0）适用于酸性蛋白酶 甲液? 称取乳酸（80％～90％）10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。 乙液? 称取乳酸钠（70％）16g，加水溶解并定容至1000 mL。 使用溶液? 取甲液8 mL，加乙液1 mL，混匀，稀释一倍，即成0.05moi/L乳酸缓冲溶液。 c、硼酸缓冲溶液（H＝10.5）适用于碱性蛋白酶 甲液? 称取硼酸钠（硼砂）19.08g，加水溶解并定容至1000 mL。 乙液? 称取氢氧化钠4.0g，加水溶解并定容至1000 mL。 使用溶液? 取甲液500 mL、乙液400 mL混匀，用水稀释至1000mL。 上述各种缓冲溶液，均须用H计校正。 2? 10g/L酪素溶液 称取酪素1.000g，精确至0.001g，用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液（若酸性蛋白酶则用浓乳酸2～3滴）湿润后，加入适量的各种适宜H的缓冲溶液约80 mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直到完全溶解，冷却后，转入100 mL容量瓶中，用适宜的H缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。 2?100ug/mL?L－酪氨酸标准溶液 a、称取预先于105℃干燥至恒重的L－酪氨酸0.1000g，精确至0.0002g，用1mol/L盐酸60 mL溶解后定容至100 mL，即为1mg/mL酪氨酸标准溶液。 b、吸取1mg/ mL酪氨酸标准溶液10.00 mL，用0.1mol/L盐酸定容至100 mL，即得到100ug/ mL L－酪氨酸标准溶液。此溶液在冰箱内贮存3? 仪器和设备 31? 恒温水浴40±0.2℃。 32? 紫外分光光度计? 应符合GB 9721的规定。 4? 分析步骤 41? 求K值 按配制不同浓度的L－酪氨酸标准溶液，然后，直接用紫外分光光度计测定其吸光度（A），以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲线（此线应通过零点） 根据作图或用回归方程，计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量（g），即为吸光常数K值（其K值应在130～135）范围内）。管? 号酪氨酸标准溶液的浓度g/mL） 取100ugmL酪氨酸标准溶液的体积 mL取水的体积 mL4.2?测定吸取酶液2.00mL、酪素2.00mL、三氯乙酸4.00 mL，其它操作条件同福林法测定中的反应、静止沉淀，直到过滤。滤液用紫外分光光度计，在275nm波长下，用10mm比色皿，测定其吸光度（A）。a、先将酷素溶液放入40±0.2℃恒温水浴中，预热5min； b、按下列程序操作： ?试管A（空白） 试管B（酶试样，需作三个平行试样） 加酶液.00 mL 加酶液.00 mL 40±0.2℃，2min40±0.2℃，2min 加三氯乙酸.00 mL（摇匀） 加酪素.00mL 已预热 （摇匀） 40±0.2℃，10min 40±0.2℃，10min 加酪素.00mL 已预热 （摇匀） 加三氯乙酸.00mL（摇匀） 10min，过滤 继续加热10min，过滤 于nm波长，测吸光 于nm波长，测吸光c、1.398和166蛋白酶，除反应与显色温度为30±0.2℃外，其它操作同 4。标准曲线作同样处理。 5? 计算 40℃下每毫升酶液每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸,定义为1个蛋白酶活力单位。 X＝A×K×8/2×1/10×n×E＝2/5×A×K×n×E式中：X——样品的酶活力，u/mL ； A——试样溶液的平均吸光度； K——吸光常数； 8——反应试剂的总体积，mL； 2——吸取酶液2.00mL； 1/10——反应时间10min，以1min计； n——稀释倍数 E——紫外法与福林法的换算系数（中性、碱性蛋白酶系数为0.50；酸性蛋白酶系数为0.77