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限制性核酸内切酶　微生物能够在获得的其他来源的ＤＮＡ中识别自己的ＤＮＡ。这种体系已经发展到识别自我和非自我，依靠细胞内部的两种酶：修饰性甲基化酶和限制性核酸内切酶。这种甲基化酶在新生的双链ＤＮＡ链上以特定的方式对各种核苷酸残基增加甲基集团。这种识别序列在长度上通常有４到７个碱基对并且是回文序列，这就是说，这种序列在ＤＮＡ一条链上与它互补链是相同的。大多数生物体具有许多不同的修饰性甲基化酶。限制性核酸内切酶作为修饰性酶识别相同的序列，但是代替甲基化，在序列上切割ＤＮＡ。然而，核酸内切酶不会切割自身序列但是会降解外援ＤＮＡ。这种识别和切开双链ＤＮＡ特殊序列的特性已经成为从许多类型的微生物中切除ＤＮＡ片段的基础。 不同种类的限制性内切酶被发现，被称为１，２，３，和４类型。只有２类型对新的DNA技术是重要的。 2类型限制性内切酶有特殊的重要性因为他们的特殊序列并且可以在精确的位置使双链DNA断裂。用这种方式切开长的外源DNA分子成为短的片段也可以在质粒载体做一个单一缺口，在这位置上DNA片段可以被插入。在一些酶的作用下，切口产生单一链末端并且对于一个给定的限制性核苷酸得到的所有片段的目的序列是相同的。用这种方法，任一片段通过一种特殊的退火增殖可以与其他通过相同核酸内切酶切割的片段进行配对，因此创造出一个杂交分子。自从来自大量细菌的限制性核酸内切酶发现以后，命名细菌的一套专业术语就被采用了。宿主微生物的属名和种名由类型的首字母确定，并且种名的前两个字母用斜体字形成三个字母的缩写。例如，E。coli，Eco.菌株和类型用无下滑线记号鉴定并且核酸内切酶的号码用罗马数字—EcoRⅡ. 不同的核算内切酶可以用于产生不同尺寸的DNA片段使不同的3‘或5’单链延长。这种DNA片段可以用电泳纯化。 通过EcoR1水解PBR322的单一目的位点或者通过限制性核酸内切酶因为有一个单一的目标位点，改变环状制粒成为线状DNA分子。 这个位点可以通过有两个折叠对称轴的2型限制性核酸内切酶识别：它们可以是4，5，或6核苷酸序列。DNA切割酶可以产生既不是平的也不是粘性末端，粘性末端很少有不成对的核苷酸终点在末端既不是3‘羟基也不是5’磷酸基团。许多有用的限制性核酸内切酶识别4或6核苷酸再生位点。因此2型Hinc酶切割六个碱基对序列的中间位置将导致钝边DNA分子形成，只能通过DNA连接酶以很低的效率被结合。EcoR1切割远离中心的识别位点并且由于酶切割位点的自然再生性导致双链DNA片段和单链接头或者粘性末端的形成。当这些片段混合起来时，氢键连接发生在单链序列互补的碱基中最后形成联合体。 平均每4096个碱基对中有一个特殊的6核苷酸序列出现。识别4核苷酸序列的内切酶所产生的片段，其平均长度应为256个碱基对：指出一个35000分子量的典型蛋白质所需要的密码子的DNA总数大约是1000个核苷酸的长度。 用于克隆的DNA片段比使用限制性内切酶也需要被获得：这些包括机械剪取，声波降解法，化学合成法，或者使用反转录酶从真核RNA模板上合成‘复制DNA’。最后的方法克服了高等真核生物大部分基因所具有的典型特征内含子或间插序列的问题。真核生物DNA在细菌中复制时内含子不能被移动，然而在真核生物表达时他们通过连接初始RNA在基因复制时被移动。 接合载体 插入和链接DNA片段进入质粒载体可以通过好几种方法完成。 使用大肠杆菌或T4噬菌体DNA处理的DNA混合片段将在克隆质粒和DNA分子中产生共价连接。共价磷酸二酯键将在通过粘性末端已经退火的片段中形成。 一个最低效率的连接方法是平头末端或完全平齐末端连接。在这种情况下DNA分子没有单练DNA的投影基因，要求高浓度的DNA末端和酶以提高连接。然而这种方法在当前水平下不能用于广泛的核酸内切酶广泛增长DNA。当这种杂交行成时，他不能被用于产生原始DNA片段的核酸内切酶切割。 这种可能存在的劣势可以使用ie接头被克服，短的合成多核苷酸，包括一个或更多核酸内切酶序列。许多接头现在已经存在，它允许DNA目的片段简单的修饰。接头序列的使用允许平头末端连接到DNA片段，通过适当的核酸内切酶切割接头形成特殊的目的需要。用这种方法克隆的片段可以简单的从重组质粒中重复分离，通过正确的核酸内切酶消化。 一个很少使用的方法包括在载体3‘末端加入一个有几个脱氧鸟苷的尾巴，并且脱氧胞嘧啶插入到剩余的3’末端，因此形成插入互补的伸长单链和载体。通过碱基配对结合，连锁反应发生了。 插入DNA片段的质粒新产品叫做一个假想质粒。 转化 这种让DNA产品进入细菌的技术已经很长时间被重视，并且可以包括染色体或质粒DNA。当噬菌体DNA被包裹的时候转化就发生了。 一个典型的质粒转化实验将有一个DNA分子的异构混合物， DNA分子只有很少数量包括一个单一的载体质粒连接