免疫组化操作规程试卷.doc

免疫组化操作规程（一）、仪器设备 ? ?1）18cm不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉； ?2）水浴锅 ? ?1）PBS缓冲液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L， KH2PO4 1.4mmol/L。 ?2）0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸 0.4g。3）0.5mol/L EDTA缓冲液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O，用10 mmol/L NaOH调至pH8.0,加水至1000ml。4）1mol/L的TBS缓冲液（pH8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0,加水至1000ml。 5）酶消化液： a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2(pH7.8) 配制。 b、0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。6）3%甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。 ?7）封裱剂：a、甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.0～9.5）等量混合；  ?b、油和TBS(或PBS)配制。 ? ?8）TBS/PBS pH9.0～9.5，适用于荧光显微镜标本；pH7.0～7.4适合于光学显微镜标本。  ? ?1、脱蜡和水化 60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。 1）组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟； ?2）无水乙醇中浸泡5分钟； ?3）95%乙醇中浸泡5分钟；  ?4）70%乙醇中浸泡5分钟；  ?2、抗原修复 用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。 1）抗原热修复1）高压热修复 EDTA（pH8.0）或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）。盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。2）煮沸热修复 电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10~15分钟。 （3）微波热修复 0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5~10分钟，反复1-2次。适用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。  2）酶消化方法 0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热至37℃，切片也预热至37℃，消化时间约为5~30分钟；胃蛋白酶消化37℃时间为30分钟。适用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。3、免疫组织化学染色  ?SP法 ?1）脱蜡、水化； ?2）PBS洗2～3次各5分钟；3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室温静置10分钟； ?4）PBS洗2～3次各5分钟；  ?5）抗原修复；6）PBS洗2～3次各5分钟； ?7）滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟。甩去多余液体。8）滴加Ⅰ抗50μl，室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。 ?9）4℃过夜后需在37℃复温45分钟。10）PBS洗3次各5分钟； ?11）滴加Ⅱ抗40～50μl，室温静置，或37℃1小时；12）II抗中可加入0.05%的tween-20。 ?13）PBS洗3次各5分钟；14）DAB显色5～10分钟，在显微镜下掌握染色程度； ?15）PBS或自来水冲洗10分钟；16）苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化； ?17）自来水冲洗10～15分钟； ?18）脱水、透明、封片、镜检。 SABC法 ?1)脱蜡、水化。 ?2)PBS洗两次各5分钟。3)用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2，室温封闭5～10分钟，蒸馏水洗3次。 ?4)抗原修复。 ?5)PBS洗5分钟。 6)滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体。7)滴加Ⅰ抗,室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时（4℃过夜后在37℃复温45分钟）。 ?8)PBS洗三次每次2分钟。9)滴加生物素化二抗,20℃～37℃20分钟。 ?10)PBC洗3次每次2分钟。11)滴加试剂S