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1?材料和方法 1.1?材料 1.1.1?组织和细胞的来源： 1.1.2?仪器设备 ?机械组织匀浆器 低温高速离心机?(40,000?g) 超速离心机 超生细胞破碎仪 超纯水装置? ? 1.1.3?试剂 ?三氯醋酸?(TCA) 丙酮 二硫苏糖醇?(DTT) 尿素 CHAPS? PMSF? EDTA? 乙醇 磷酸 考马斯亮蓝R350?? 抑肽素A? 亮肽素 试剂纯度均应是分析纯或以上。1.1.4?溶液配制? (1)???PBS：? NaCl?8?g,?KCl?0.2?g,?Na2HPO4?1.44?g,?KH2PO4，溶于800?ml水中，用HCl调pH至7.4，用纯水定容至1?L；? (2)???EDTA?储存液：? 18.61?g?Na2EDTA·2H2O，溶于70?ml纯水中，用10?mol/L?NaOH调节pH值至8.0?(约需2?g?NaOH颗粒)，定容为100?ml。可高压灭菌后分装备用；? (3)???亮肽素储存液?(50?μg/ml，100×)? 10?mg/ml溶于水，-75保存；使用时配成50?μg/ml储液，-20保存；? (4)???抑肽素储存液?(70?μg/ml，100×)? 1?mg/ml溶于甲醇，-75保存；使用时配成70?μg/ml储液，-20保存；? (5)???PMSF储存液?(10?mM,?100×):? 17.4?mg?PMSF，溶于1ml异丙醇中，-20?保存。? (6)???DTT?储存液?(1?M):? 0.31?g?DTT溶于2?ml?H2O中，-20?保存?(DTT或含有DTT的溶液不能进行高压处理，可过滤除菌)。? (7)???裂解液:? Lysis?buffer?A? (9?M?urea,?4%?w/v?CHAPS,?1%?w/v?DTT,?0.5%?CA?and?a?cocktail?of?protease?inhibitors)Lysis buffer B(7 M urea, 2 M thiourea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors)?? Lysis buffer C 40 mM Tris-base (pH 9.5) in ultrapure H2OLysis buffer D(8 M urea, 4% CHAPS, 40 mM Tris(base), 40 ml)Lysis?buffer?E (5?M?urea,?2?M?thiourea,?2%?SB?3-10,?2%?CHAPS,?1%?w/v?DTT,?0.5%?CA?and?a?cocktail?of?protease?inhibitors)Lysis buffer F100 μL SDS sample solution (1% w/v SDS, 0.375 M Tris-HCl, pH 8.8, 50 mM DTT, 25% v/v glycerol)●CA、蛋白酶抑制剂混合物和DTT在临用前加入。(8) 蛋白酶抑制剂混合物[3] 成分 终浓度 蛋白酶抑制剂混合物 PMSF 35 μg/ml or 1 mM EDTA 0.3 mg/ml (1 mM) 抑肽素 0.7 μg/ml 亮肽素 0.5 μg/ml 1.2?方法 1.1.1组织蛋白提取方法1.2.1.1三氯醋酸/丙酮沉淀法[1] (1)冰上取材，称湿重，置液氮中冻存或直接进行下一步； (2)在液氮中研碎样品或使用机械匀浆器磨碎组织； (3)将粉末悬浮于含DTT(0.2%w/v)的10%三氯醋酸（w/v）的丙酮溶液中； (4)蛋白–20沉淀过夜； (5)35000×g(6)离心30min； (6)将沉淀重悬于含0.2%DTT的预冷丙酮中； (7)-20放置1h； (8)35000×g(6)离心30min； (9)在通风橱中让丙酮充分挥发，得到干燥的沉淀； (10)在裂解液中重新溶解沉淀（50-100mg组织需要1ml裂解液）； (11)15,40000×g，离心1hr； (12)用Bradford法[2]测定上清的蛋白浓度，分装后置–75保存。 1.2.1.2超速离心法 (1)取材； (2)用研钵在液氮冷冻条件下将样品研成粉末，每1g样品加入0.5ml裂解液，使用组织匀浆器匀浆30s； (3)组织悬液15，10000×g离心10min； (4)上清液4，150000×g超速离心45min； (5)小心避开上层漂浮的脂质层，吸取离心上清640,000g再次离心50min；