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病原微生物实验重点 高压蒸汽灭菌（最常用，最有效的一种湿热灭菌法）的原理和作用： 原理：如果蒸汽被限制在一个密闭的容器（高压蒸汽灭菌器）中，随着压力的升高，蒸汽的温度也相应升高。在103.4KPa蒸汽压下，温度达到121.3℃，维持20-30min可杀灭包括细菌芽孢在内的所有微生物（但不能杀灭活朊粒） 作用：适用于包括液体在内的各种耐热，耐潮湿物品的灭菌 血清肉汤培养基的用途：用于培养乙型溶血性链球菌等营养要求较高的细菌 血琼脂培养基的用途：主要用于分离培养营养要求较高的细菌和观察某些细菌的溶血现象 双糖铁培养基的原理及用途：双糖培养基乳糖：葡萄糖=10:1，若细菌能分解两种糖，因产酸量多，整个培养基将由红变黄；若只能利用葡萄糖，因产酸量少，斜面表面积大，有机酸易挥发氧化，结果培养基底部变成黄色，斜面仍保持红色。该培养基还含有亚铁离子，可与硫化氢生成黑色沉淀，所以利用此培养基还能观察到某些细菌分级含硫氨基酸产生硫化氢的情况。由于该培养基是半固体培养基，还可用于有无鞭毛（痢疾杆菌无鞭毛）的鉴定。本培养基主要用于肠道致病菌的鉴定。 S-S琼脂培养基的原理及作用：①主要用于分离肠道致病性沙门菌属和志贺菌属的细菌 ②培养基的选择成分主要体现在煌绿对球菌生长有抑制作用，有助于肠道致病菌的生长；胆盐，枸橼酸钠，硫代硫酸钠可抑制革兰阳性细菌和大多数的大肠埃希菌属细菌的生成，枸橼酸铁能中和中性红的毒性作用，并能与硫代硫酸钠作为还原剂，避免某些细菌产生的硫化氢被氧化③培养基的鉴别作用体现在不发酵乳糖的沙门菌属和志贺菌属细菌，在平板上形成的菌落不着色，呈半透明。大肠埃希菌能发酵乳糖，产生的酸使胆盐沉淀，胆盐与中性红结合，使菌落呈红色，在平板上可见培养基中红色成片的乳浊状沉淀。某些变形杆菌和沙门菌还能分解含硫氨基酸产生硫化氢，使菌落中心成黑色。此外，细菌在该平板上生长后，分解蛋白质产生氨基酸等碱性代谢物，使平板PH值升高，培养基由红变黄 罗氏培养基的用途：主要用于结核分枝杆菌的培养（结核杆菌在该培养基上生长缓慢，呈菜花样） 油镜的放大倍数：90或100（光学显微镜的分辨率为0.25μm） 观察细菌鞭毛所用方法：压滴法，悬滴法，半固体鞭毛穿刺法 细菌的革兰染色法： ①原理：革兰阳性细菌的细胞壁结够比较致密，肽聚糖含量高且交联度大，脂质含量少，乙醇脱色过程中，虽然能溶解细胞壁的脂质而在壁上形成小孔，但脱水作用使细胞壁收缩构成屏障，通透性降低，阻止细胞内的结晶紫-碘复合物的溢出，细胞仍保持结晶紫初染的紫色。而革兰阴性菌的细胞壁结果较为疏松，肽聚糖层较薄，厚厚的外膜层含有丰富的脂质，具有良好的溶脂作用的乙醇溶解脂质，细胞壁的通透性增高，细胞内的结晶紫-碘复合物溢出，细菌脱色，经复染后呈红色 ②方法：1）涂片标本的制作涂片[菌膜要薄]---干燥---固定[固定时将玻片来回通过火焰3次，时长2-3s] 2)染色及镜检结晶紫初染[1min,用水冲洗]-----碘液媒染[1min用水冲洗]-95%乙醇脱色[about30s用水冲洗]-----复红复染[稀释苯酚复红1min用水冲洗]-镜下观察 ③注意事项；1）涂片是菌膜要薄而均匀。2）注意乙醇脱色的时间3）用水冲洗时不应直接对准菌膜，应倾斜载玻片，让水自上而下冲去多余的染料 细菌的抗酸染色法； 原理；抗酸染色是细菌染色后不被盐酸乙醇脱色的染色方法，主要用于细菌抗酸性的鉴定。结核分枝杆菌等分枝杆菌属及少数放线菌为抗酸阳性菌。这类菌细胞壁脂质含量丰富，用一般染色方法不易着色，若通过加热或延长染色时间促使染料苯酚复红渗透，使其着色后，其脂质中主要成分分枝菌酸即表现出抗乙醇盐酸脱色的能力。而其他菌则会被脱色，经亚甲蓝复染成蓝色。 方法；1）涂片标本的制作；涂片[菌膜要厚]——干燥——固定[玻片来回通过火焰5次] 2）染色及镜检；初染[浓苯酚复红，缓慢加热至有蒸汽冒出，5min，不能干涸、不能沸腾，如若干涸，可补充染液，冷却后用水冲洗]——脱色[3%盐酸乙醇脱色，无时间限制，直至标本最厚处无红色脱出为止，用水冲洗]——复染[亚甲蓝，1min，用水冲洗]——镜下观察 培养基：是依据细菌的营养类型，按一定的培养目的而人工配制的满足细菌或其他微生物生 长繁殖或积累代谢产物的营养基质 培养基类型 凝固剂的添加 主要用途 液体培养基（呈淡黄色，透明澄清）[液体培养基接种法] 未添加 快速增菌培养，细菌生长动态的观察，细菌的生化反应的检测 固体培养基（呈琼脂的灰白色）[分区划线法，连续划线法，蛇形划线法] 2%—3%的琼脂 平板可用于细菌的分离纯化，鉴定，计数及药物敏感试验，斜面可用于菌种的短期保存 半固体培养基（呈琼脂的灰白色）[半固体穿刺接种法] 0.5%—0.8%的琼脂 细菌动力观察，菌种的保存，细菌的生化反应