松嫩草地土壤细菌群落16S rDNA V3片段PCR产物的DGGE分析.docVIP

松嫩草地土壤细菌群落16S rDNA V3片段PCR产物的DGGE分析 　　摘 要：从松嫩草地9种植物群落覆盖下的土壤中抽提细菌总DNA，直接扩增16S rDNA V3可变区，应用变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析16S rDNA V3可变区的多态性，发现不同种类植物群落地下土壤细菌的种类以及生物量都有所不同，并且地上植被的盖度影响了地下土壤微生物的物种多样性。 　　关键词：松嫩草地；土壤细菌群落 ； 16S rDNA；DGGE 　　中图分类号：Q938.13 文献标识码：A 　　土壤微生物是土壤的重要组成部分，微生物的多样性代表着微生物群落的稳定性。土壤微生物不仅能够改善土壤的结构；促进土壤养分转化与循环；更能为地上植被储备养分，促进植物的吸收，增加植物的抗性，为植物的多样性提供有利的条件[1]。所以土壤微生物群落多样性与覆盖在土壤上的植物群落多样性呈正相关。通过研究植物群落结构对土壤微生物多样性的影响，可以得到该地区土壤微生物遗传信息在微生物聚集地或群落中的量和分布，反映微生物群落中总的遗传潜力，为今后探讨研究土壤微生物与植被的关系；植物、动物以及微生物的之间互作关系与生态环境保护提供科学依据。 　　不经过传统的微生物分离培养步骤，直接从土壤中抽提总DNA，利用变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）分析16S rDNA的序列多态性[2]，以此反映微生物的种群结构。该方法重现性较强、可靠性高，可以有效克服传统方法的缺点，能够更深入的揭示的土壤微生物种群结构。 　　本实验利用DGGE技术，在分子水平上研究松嫩草原不同地表植被对土壤中微生物种群结构的影响，探讨处于不同地表植物覆盖的松嫩草地土壤微生物群落结构上的变化，为从土壤微生物的角度探讨松嫩草地退化的机理提供科学依据，并为草原生态系统的恢复提供更直接的信息。 　　1材料与方法 　　1.1材料 　　1.1.1土壤样品 　　土壤样品采自吉林省长岭县腰井子前金山试验地，土样地表的植物群落为单一优势物种，分别是虎尾草（Chloris virgata），羊草（Leymus chinensis），牛鞭草（Hemathria sibirica），拂子茅（Calamagrostis epigeios），全叶马兰（Kalimeris integrifolia），全叶马兰（Kalimeris integrifolia），罗布麻（Apocymum venetum L.），碱地肤（Kochia sieversiana），芦苇（Phragmites australis）和星星草（Puccinellia tenuiflora）。土壤取样时，以不同植物群落为参照，在群落内随机抛投25x25cm2样方，采样深度为5～20cm，采用五点取样法采集土壤样品。 　　1.1.2主要试剂和引物 　　试剂盒Wizard PCR PrepsDNA Purification System购自美国Promega公司，引物选择细菌的16SrDNA的V3高变区通用引物[3]，引物序列338F-GC：5-CGC GCC GCC CGC GCG CCG GGC GCG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAG GGG AGG CAG CAG-3，518R：5-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 　　1. 2 方法 　　1.2.1土壤样品预处理 　　将土壤样品混匀，过20目的筛网，称取2g土壤样品，置于离心管中；加入5mL TENP 抽提缓冲液，旋祸震荡10min；12000转/min，室温离心5min，弃上清；在沉淀中加入5ml TENP，震荡10min，重复（2）（3）2次；加5mL PBA 缓冲液，震荡10min；12000转/min，室温离心5min，弃上清，收集沉淀。 　　1.2.2土壤中细菌总DNA的提取 　　加入2mL DNA提取液，旋祸震荡5min；加入100μL溶菌酶与100μL蛋白酶K，37℃恒温水浴震荡30min；加入500μL SDS，旋祸震荡10min；4℃离心10min，收集上清；加入等体积的氯仿/异戊醇（24： 1）抽提1次，12000转/min，离心5min，收集上清；加入等体积异丙醇，颠倒混匀，12000转/min，4℃离心10min，弃上清；DNA沉淀用70%乙醇洗，12000转/min，室温离心5min，干燥后将DNA沉淀溶于100uL无菌水中。 　　1.2.3 16S rDNA V3片段PCR扩增 　　PCR反应体系：10×PCR缓冲液5μL（含Mg2+），dNTP（10mmol/L） 1μL，引物各2μL，Taq