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食品生物技术 第3章第5节重组DNA导入受体细胞 一、基本概念 1克隆（cloning） 即外源基因的无性繁殖，是指将目的基因与载体连接成的重组DNA导入受体细胞，进行扩增和筛选，产生大量重组子的过程。 2受体细胞 又称宿主细胞，是能摄取外源DNA，并使其稳定维持的细胞。分为原核受体细胞（主要是大肠杆菌）、真核受体细胞（主要是酵母菌）动物细胞和昆虫细胞（其实也是真核受体细胞） 3感受态细胞 能够吸收游离DNA片段的细菌细胞。 4感受态细胞的制备 在冰浴中用一定浓度的CaCl2处理对数生长期的细菌，以获得高效转化的感受态细胞。其目的是增加受体菌细胞膜的通透性。 5转化（transformation) 遗传性状发生改变的方法； 6转染（transfection） 是将携带外源基因的病毒感染受体细胞的方法。 二、重组DNA导入受体细胞的方法 1. 转化 （1）热休克法（heat shock） 简单，但转化效率不高（106-108/(gDNA） （2）电转化法 转化效率高 （高于109/(gDNA） 热休克转化 电穿孔转化 将待转化的质粒加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场。在强大电场作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内。适用于真核及原核细胞外源DNA的直接导入。 2、磷酸钙沉淀法 ？ ①原理： HEPES？缓冲盐水与含有氯化钙和DNA的溶液缓慢混合，会形成含磷酸钙和DNA的沉淀。从而导入大肠杆菌和哺乳动物细胞。 ②优点:不需要载体 缺点:依据不同的细胞类型，平皿上最多能有10%的细胞能吸收DNA沉淀 3、脂质体（lipofectin）载体法 脂类包埋DNA，通过细胞膜进入细胞 4. 体外包装的噬菌体的转导 （1）体外包装（in vitro packaging） 把重组的噬菌体(DNA或Cosmid质粒DNA包装成具有感染能力的(噬菌体颗粒； （2）转导（transduction） 通过受体菌细胞表面的(DNA接受器位点（receptor site)，使带有外源基因的重组体DNA注入受体大肠杆菌进行扩增。 体外包装过程示意图 5、显微注射法(microinjection) 直接把外源DNA注射到宿主细胞核里，使其整合到染色体上。（常用于转基因动物的基因转移） 三、植物细胞转化技术 1、土壤农杆菌Ti Ti质粒--存在于能引起植物形成冠瘿瘤的土壤农杆菌中，诱导冠瘿瘤形成，又称肿瘤诱导质粒（tumor inducing plasmid）。 第一步:植物受伤 受伤后分泌的一些物质诱导毒性基因表达。 第二步： 感染植物（农杆菌感染伤口） 第三步： 毒性基因（vir）表达（virA、virG、virD、virB） 第四步： T-DNA转移 T-DNA被vir基因产物切下来，并运送到植物细胞核里，整合到植物基因组中。 第五步： 诱导冠瘿瘤 T-DNA上的产物催化产生过量的生长素和细胞分裂素，形成植物冠瘿瘤。 2、叶盘法（leaf disk) 叶片消毒-切取部分叶片-农杆菌夜浸泡-诱导分化去分化 3、电击法（electroporation) 4、基因枪法（gene gun）:又称高速微型子弹射击法 第六节 重组体的筛选与外源基因的鉴定 筛选： 根据载体表型筛选 根据插入报告基因的表型筛选 鉴定： 根据重组DNA分子特征鉴定重组子 根据目的基因的转录产物(mRNA)鉴定重组子 根据目的基因翻译产物(蛋白质)鉴定重组子 (一)根据载体表型筛选 (-半乳糖苷酶显色反应选择法 ⑴原理: 载体上有一段(-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的(片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位点。受体菌基因组中有突变的(-半乳糖苷酶基因（(片段缺失），可以被IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导表达。载体和受体菌基因组可以互补形成完整有功能的(-半乳糖苷酶。 ⑵选择过程 (二)根据报告基因的表型筛选 原理：报告基因多数是酶的基因,或组装在载体上或作为外源基因DNA的一部分,报告基因的表达使得受体细胞具有新的遗传性状。 (三)根据重组DNA分子特征鉴定重组子 1. 根据重组DNA分子大小鉴定 利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大，从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、比较其分子量。 2.重组DNA分子酶切电泳筛选法: 原理： 根据已知的外源DNA序列的限制性酶切图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）。或用合适的内切酶切下插入片断，再用其它酶切这个片断，电泳后比较结果是否符合预计的结果。 3.PCR扩增检测法 ⑴原理:PCR能在模板序列上扩增出预期DNA片断 ⑵过